Лабораторна робота № 2.3. Визначення вмісту біотину в дріжджах

Суть методу:

Біотин – вітамін Н, що входить в групу вітамінів В, є стимулятором росту дріжджів. Щоб забезпечити нормальну швидкість росту і брунькування дріжджів, біотин повинен знаходитись в живильному середовищі в достатній кількості – не менше 200 мг на 1 т сировини.

В бурачаній мелясі зазвичай біотину недостатньо для швидкого накопичення біомаси. Тому в мелясу додають речовини, що містять біотин. Важливо знати, скільки біотину міститься в сировині, що переробляється і в інших продуктах – рослинних екстрактах, автолізаті дріжджів і ін.

А) приготування стандартного ряду розчинів вітамінів

Методика приготування

Тест-організм – культуру дріжджів Saccharomyces cerevisiae раси №7 – підтримують на сусло-агарі , пересівають її не рідше одного разу в місяць з попереднім помолом в рідкому солодовому суслі протягом 18-20 год з наступним посівом на скошений сусло-агар. Вирощування культури проводять при 30 ⁰С, зберігають при кімнатній температурі або в холодильнику при 4-5 ⁰С.

Аналіз починають з приготування стандартного ряду розчинів вітамінів: в штатив поміщають дев’ять пробірок ємністю 10 мл і по 2-3 пробірки на кожен зразок досліджуваної речовини. В кожну пробірку наливають розчини в наступних кількостях в мл.

Розчини	Кількість в мл
20%-ний розчин сахарози	1
Розчин А	0,5
Розчин В	0,5
ZnSO4	0,1
CuSO4	0,1
Буферний розчин	0,1
Дистильована вода стерильна	2,0

Усі пробірки поміщають в киплячу водяну баню на 1 хв, потім охолоджують і додають розчини вітамінів (табл.2). У вісім пробірок з дев’яти додають розчин чистого біотину у зростаючій кількості (табл.3).

Таблиця 2

Вітамін	Кількість, додана в розчин
	в мл	в γ
Тіамін В1	0,1	2
Рибофлавін В2	0,1	1
Нікотинова кислота	0,1	50
Р-Амінобензойна кислота	0,1	3
Піридоксин	0,1	10
Пантотенат кальцію	0,1	5
Мезоінозитол	0,1	500

Таблиця 3

Номер пробірки	Кількість біотину в γ
1	0,001
2	0,003
3	0,005
4	0,0075
5	0,01
6	0,02
7	0,03
8	0,04

Потім у всі пробірки додають емульсію дріжджів з таким розрахунком, щоб в кожній пробірці була однакова кількість дріжджових клітин – біля 1 млн. Для цього одну петлю агарової культури розмішують в 10 мл стерильного фізіологічного розчину і потім визначають кількість клітин в 1 мл емульсії шляхом підрахунків в лічильній камері чи за нефелометром.

Доводять пробірки до мітки стерильною дистильованою водою і переливають в стерильні колбочки. Пробірки виполокують 1 мл води, щоб в колбах було 11 мл рідини. Колбочки з культурою дріжджів поміщають в термостат при 30оС на 20-24 год, протягом цього часу їх збовтують 3-4 рази і підтримують рН середовища в межах 4,5-5,5, додаючи ідкий калі. Після закінчення терміну вирощування підраховують кількість клітин в колбочках за допомогою лічильної камери чи за допомогою нефелометра.

Заповнюють таблицю і викреслюють стандартну криву.

Номер колби	Кількість доданого біотину в γ	Кількість клітин, що виросли в 1 мл середовища в млн.шт.
1...9	0,001 .... 0,04