7.3.3. Биологический метод
Биологический метод заключается в заражении мокротой морских свинок, который очень чувствительны к МБТ. Данный метод требет всего 5 микробных тел в 1 мл для обнаружения збактерии, однако недостатки данного метода очевидны и он в настоящее время практически не применяется. [1]
7.3.4. Рентгенологические методы
Флюорография – традиционный массовый метод выявления туберкулёза. Его суть заключается в фотографировании изображения с рентгеновского экрана или с экрана электронно-оптического усилителя на фотоплёнку. Он позволяет обнаружить в лёгких гранулёмы и другие нарушения, вызванные деятельностью МБТ. В случае, если возникает подозрение на туберкулёз, проводятся дополнительные исследования, такие как рентгенография или томография. К сожалению, метод обычно не позволяет выявить нарушения на ранней стадии из-за относительно невысокой разрешающей способности. Недостатком метода также является отрицательное воздействие излучения на человека. Также данный метод требует специального дорогостоящего оборудования. [1]
7.3.5. Серологические методы
[Антиген-антитело]
7.3.6. Туберкулинодиагностика (тест Манту)
[1,54]
7.4. Решение задачи
В 2004 году биотехнологическая компания Cepheid объявила о создании новейшего метода определения туберкулёза Xpert MTB/RIF. Новый метод определения туберкулёза был предложен доктором Катариной Боехм и её коллегами. Метод представляет собой полностью автоматизированный молекулярный тест с использованием картриджей.
Метод основан на проведении полимеразной цепной реакции, а все необходимые для этого процессы (подготовка образца, амплификация генома и определение) проводятся в автоматическом режиме и не требуют участия специалистов. Каждый картридж сожержит в себе все необходимые компоненты для проведения реакции: лиофилизированные реагенты, буферные растворы, промывные растворы. Система обнаружения работает в режиме реального времени с использованием шестицветного лазерного детектора.
Более того, метод позволяет не только определить наличие бактерии туберкулёза в пробе, но и исследовать её на устойчивость к рифампину – основному лекарстенному препарату против туберкулёза. Это очень важная составляющая метода, поскольку некоторые формы туберкулёза являются устойчивыми к действию рифампина, что вызвано определённой мутацией в одном из генов бактерии.
Суть метода заключается в предварительной обработке клинических образцов, а затем проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого образцы лизируются, ДНК изолируется и амплифицируется, а затем ампликон идентифицируется. Полимерзная цепная реакция в режиме реального времени амплифицирует специфическую последовательность гена rpoB, которая затем тестируется молекулярными маяками на мутации в районе устойчивости к рифампину.
Схематично процесс можно изобразить следующим образом (рис. 2):
Образцы обрабатываются реагентом в соотношении 1:2. Смесь инкубируется 15 минут при комнатной температуре и дважды взбалтывается в течение этого времени.
2 миллилитра смеси образца наносится на картридж.
Картридж вставляется в оборудование, дальнейшее участие человека для исследования не требуется.
Образец автоматически фильтруется и промывется.
Ультразвуковая обработка выделяет ДНК из смеси образца с реагентом.
ДНК перемешивается с сухими компонентами, необходимыми для полимеразной цепной реакции.
ДНК гена rpoB амплифицируется, затем проводится детекция молекулярными маяками.
Результаты сохраняются на компьютере и доступны для анализа.
Рис. 2
Секвенирование последовательности ДНК в обоих направлениях производится в процессе полимеразной цепной реакции на 81 нуклеотидах основного района гена rpoB, ответственного за устойчивость к рифампину. Фрагмент амплифицируется при помощи готового набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit на оборудовании 3130xl Genetic Analyzer.
Данный метод был одобрен ВОЗ и уже активно внедряется в массовое использование. С декабря 2010 года по конец июня 2012 года странами с небольшим и средним уровнем дохода уже было куплено 1,1 млн картриджей. Основным покупателем стала Южная Африка (37% продаж). На данный момент стоимость одного теста составляет $ 9.98.
Метод определения Xpert MTB/RIF на сегодняшний день является наиболее продвинутой технологией в области диагностики туберкулеза. Простота использования данного метода позволяет применять его в любой точке земного шара. Кроме того, эта технология позволяет выявлять туберкулез у ВИЧ-инфицированных пациентов, что обычно является проблемой при прочих существующих методах.
Таким образом, данный метод имеет широкий ряд преимуществ:
высокие точность и эффективность;
экспрессность и высокая производительность;
автоматизация процесса подготовки пробы;
изолированная обработка пробы (минимальное влияние внешних факторов)
простота использования (не требуются квалифицированные специалисты);
требуется совсем мало обслуживающего персонала;
исследование устойчивость возбудителя к рифампину;
возможность выявления туберкулёза у ВИЧ-инфицированных;
безопасность для обслуживающего персонала.
К сожалению, у данного метода существуют и недостатки. Одним из них является необходимость калибровки прибора. Но главным недостатком в настоящее время является относительно дорогая стоимость метода. Однако с учётом того, что прибор заменяет собой целую исследовательскую лабораторию и позволяет получать результат со значительно более высокой точностью и выявлять больше опасных случаев заболевания, чем, например, метод Циля‑Нильсена, в конечном итоге данный метод окупит себя.
Низкая эффективность существующей диагностики туберкулеза, а также возрастающее по всему миру число пациентов с устойчивостью к рифампину требует новых экспрессных и эффективных методов, каким и является Xpert MTB/RIF.