Иммуноферментный анализ
(ИФА, ELISA-Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay, EIA- Enzyme Immuno Assay)
Применяется в диагностических целях, при определении в сыворотке крови специфических антител к возбудителю подозреваемой патологии. Используются специальные планшеты из полистирола, с круглыми плоскодонными лунками, вместимостью около 300 мкл. На планшете 96 лунок (8 рядов по 12 лунок).
Перед анализом планшету сенсибилизируют, нанося раствор антигена. Обычно это не целая структура возбудителя, а часть (наиболее характерная) белков его оболочки. Часто антигены для ИФА получают генноинженерными технологиями, выращивая на трансгенных E.Coli. Растворимые антигены закрепляются на поверхности планшеты рядом специфических взаимодействий непосредственно из раствора. Для снижения помех участки незанятой антигеном поверхности “укрывают” нанесением раствора бычьего сыровоточного альбумина. Несвязанный материал удаляют и планшету сушат. Сенсибилизированные планшеты можно хранить при –18 ºС не более 2-х недель.
При выполнении анализа лунки заполняют исследуемым материалом (сыворотка крови), нанося его в разные лунки с дробным разбавлением (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и т.д.), после чего выдерживают около 30 мин для связывания. Если в образцах имеются антитела, комплементарные нанесенному антигену, они образуют с ним прочные комплексы. Образцы из лунок удаляются и несвязавшийся материал удаляется трехкратной промывкой буфером. Далее лунки заполняются раствором конъюгата, представляющего собой связанные глутаровым альдегидом молекулы белка-фермента (чаще всего пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) и молекулы антител против антител к возбудителю, полученные из сыворотки кролика (или другого организма) при введении в его кровь антител человека к искомому возбудителю. Дают время на прохождение реакции комплементарного связывания, после чего избыток раствора конъюгата удаляется и лунки промываются буфером. Молекулы конъюгата осаждаются на молекулах осадившихся на антигене антител из испытуемого образца. В довершение всего лунки заполняют раствором субстрата, превращение которого в окрашенный продукт осуществляется конъюгированным ферментом. Такое ферментативное превращение осуществляется примерно 60 мин, после чего реакция останавливается добавлением кислоты. Количество превращенного субстрата пропорционально концентрации конъюгата и, следовательно, концентрации антител против возбудителя в исследуемом образце. По плотности окраски в УФ-свете можно судить о концентрации антител в исследуемой сыворотке. В “холостых” контрольных лунках параллельно проводят реакцию для установления порога “шумов”. Имеются также лунки, заполненные антителами из контрольного раствора для проверки специфичности реакции.
В качестве субстратов применяют: 1) для конъюгатов с пероксидазой хрена – о-фенилендиамин в смеси с перекисью водорода, которые дают после остановки реакции оранжево-коричневые растворы (поглощают свет при 492 нм); 2) для щелочной фосфатазы – п-нитрофенилфосфат, превращающийся в п-нитрофенол (поглощает свет при 405 нм).
ИФА повышает чувствительность анализа благодаря "усилению сигнала" на конъюгированном ферменте. На каждую молекулу исследуемого в сыворотке антитела "садится" по одной молекуле фермента, которая способна катализировать превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Однако и чувствительность ИФА имеет ограничения. В некоторых случаях (например, при приеме донорской крови) требуется проводить процедуру PCR для подтверждения отсутствия антител к вирусу СПИД и некоторых других заболеваний. Дело в том, что в первые дни после заболевания число антител в крови может оказаться настолько малым, что ИФА часто дает так называемую "серонегативную реакцию", то есть не индицирует антитела при имеющемся в крови возбудителе.