1. Выделение биомолекул.

Ниже перечислены основные методы, используемые для разделения и очистки биомолекул. Почти всегда очистить биомолекулы до состояния гомогенности (т. е. до отсутствия загрязнения любыми другими биомолекулами) удаётся лишь при последовательном применении нескольких таких методов.

Основные методы разделения и очистки биомолекул.

Фракционирование солями (например, осаждение с сульфатом аммония)

Хроматография

1. Бумажная

2. Ионообменная (анионо- и катионообменная)

3. Аффинная

4. Тонкослойная

5. Газо-жидкостная

6. Жидкостная под высоким давлением

Гель-фильтрация

Электрофорез

1. На бумаге

2. Высоковольтный

3. В агарозе

4. В ацетатцеллюлозе

5. В крахмальном геле

6. В полиакриламиде

7. В полиакриламиде и в присутствии додецилсульфата натрия

Ультрацентрифугирование

2. Определение структуры биомолекул. После очистки биомолекул можно определить их структуру. Это – совершенно необходимое условие успешного детального изучения корреляции между структурой и функцией. Основные методы, используемые для анализа структуры биомолекул, перечислены ниже:

Основные методы определения структуры биомолекул.

1. Элементарный анализ

2. Спектроскопия в Уф-, видимой и инфракрасной областях, ЯМР-спектроскопия

3. Использование кислотного или щелочного гидролиза для расщепления изучаемых молекул на составляющие компоненты

4. Использование набора ферментов с известной специфичностью для расщепления изучаемых молекул (например, использование протеаз, нуклеаз, гликозидаз)

5. Масс-спектрометрия

6. Специфические методы секвенирования (например, белков или нуклеиновых кислот)

7. Рентгеновская кристаллография

3. Изучение функций и метаболизма биомолекул. Ниже приведены различные типы препаратов, которые используются в настоящее время для изучения биохимических процессов. В таблице препараты перечислены в порядке уменьшения их сложности.

Иерархическая последовательность препаратов, используемых для изучения биохимических процессов.

Метод	Комментарии
Исследования на уровне целого организма	Они могут включать удаление органа (например, гепатэктомия) изменение диеты (голодание – усиленное питание) приём лекарств (например, фенобарбитала) введение токсических веществ (например, четырёххлористого углерода) наблюдение за животным со специфическими заболеваниями (например, сахарным диабетом) использование сложных методов, таких, как ЯМР-спектроскопия и позитронно-эмиссионная томография
Исследование изолированного перфузируемого органа	Наиболее пригодны сердце, печень, почки
Использование тканевых срезов	Особенно срезы печени
Использование целых клеток	Особенно это относится к клеткам крови, которые относительно легко поддаются выделению Клетки в культурах тканей являются незаменимым объектом во многих областях биологии
Использование гомогената	Позволяет работать с бесклеточными препаратами Можно добавлять или удалять (путём диализа) различные соединения и наблюдать за последствиями Путём центрифугирования можно провести дальнейшее субфракционирование, что позволяет получить индивидуальные клеточные органеллы
Исследование изолированных клеточных органелл	Широко используется для изучения функций митохондрий, эндоплазматического ретикулума, рибосом и т. д.
Субфракционирование органелл	Широко используется, например, при изучении функций митохондрий
Выделение и характеристика метаболитов и ферментов	Важнейшая часть анализа любой химической реакции или метаболического пути
Клонирование генов, кодирующих ферменты и другие белки	Выделение клонированного гена необходимо для изучения деталей его структуры и регуляции; позволяет установить аминокислотную последовательность белка, который им кодируется

[11]