8.17. Спектрофотометрия: принцип, назначение.

Фотометрические приборы подразделяются на обычные фильтровые фотометры и спектрофотометры. В последних учас­тки спектра выделяют при помощи призм или дифракционных решеток; это позволяет установить любую длину волны в весьма большом диапазоне (спектрофотометры типа СФ-4, СФ-26, СФ-46, РV-1251 С «СОЛАР» и др.).

При выполнении клинико-биохимических исследований фо­тометрия чаше всего проводится в области длин волн 400—700 нм. Особенно широко распространена регистрация содержания НАД • Н и НАД • ФН по поглощению света с длиной волны 340 нм, т. е. в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрасной области при­годны кюветы из обычного стекла; для ближней ультрафиолето­вой области нужны кюветы из специальных сортов стекла — так называемого увиолевого стекла, в коротковолновой ультрафио­летовой области пригодны только кюветы из кварца и сапфира.

При проведении фотометрических исследований оценку ре­зультатов чаще всего производят тремя способами:

- по конечной точке (измерение в конечной точке);

-по фиксированному времени (примером может служить пря­мой псевдокинетический метод Яффе);

- кинетически (кинетическое измерение).

Определение по конечной точке состоит в учете образования продукта за некоторое (порой относительно длительное) время инкубации. Расчет результатов производится по стандарту.

Способ исследования по методологии «фиксированного време­ни» основан на применении спектрофотометров (типа «СОЛАР») или фотометров с обычными светофильтрами, оснащенных термостатирующим кюветным отделением, и установлении количества нарабатываемого (расходуемого) продукта за определен­ный промежуток времени с последующим расчетом концентра­ции (активности) по стандарту.

Кинетический метод исследования, как правило, является ферментативным. Выполняется при условии выделения строго монохроматизированного светового потока (благодаря примене­нию фотометров с интерференционными светофильтрами или спектрофотометров) с использованием термостатирусмой кюве­ты (при температуре 25°С, 30°С и чаще всего 37°С). После старта реакции через определенный интервал времени (например, 60 с троекратно) находят изменение оптической плотности. Из полу­ченных значений рассчитывают среднюю величину изменения абсорбции (А) и с использованием определенных (соответствующих температуре инкубации) коэффициентов производят расчет с выражением результатов в ВД/л (кат/л) и их производных.

Методы второй и особенно третьей группы обладают рядом существенных преимуществ перед одноточечными (конечной точки): их выполнение занимает мало времени, они не связаны с применением агрессивных жидкостей, точны, позволяют полу­чать достоверные результаты (в особенности при исследовании активности ферментов, когда к тому же не требуется разводить в определенное количество раз сыворотку крови для предотвраще­ния эффекта «разбавления» при гиперферментемии).

Подавляющее их большинство базируется на использовании оптического теста Варбурга, состоящего в ферментативном (с участием лактатдегидрогеназы) превращении НАД • Н в НАД (и наоборот), существенно отличающихся величиной оптической плотности при длинах волн 340 нм, 334 нм, 365 нм (см. схему).

СО₂Н ЛДГ CO₂H

| |

С= О + НАДН +H­­­_{­­­­­­­}­­­­­­⁺ HC ­­­­– OH + HAД⁺

| |

СН₃ CH₃

Основывающийся на этом оптическом эффекте принцип ­­­­­­­­ис­пользуется для определения содержания пировиноградной (ПВК) и молочной (МК) кислот ферментативным методом, в ко­тором под влиянием ЛДГ катализируются прямая и обратная ре­акция их взаимопревращения.

При определении активности многих ферментов, содержания субстратов, метаболитов, некоторых электролитов ход энзиматических процессов в реакционной смеси «замыкается» на превра­щении ПВК в МК (и наоборот) с участием лактатдетидрогеназы и НАД • Н (НАД). Так, в методике определения активности аланинаминотрансферазы используются следующие реакции:

1. Аланин +-кетоглутаровая к-та ПВК + Глутаминовая кислота

НАД • Н₂

2. ПВК МК + НАД.

ЛДГ

Наряду с ЛДГ используется также малатдегидрогеназа (МДГ).

Кинетическим методом, базирующимся на оптическом тесте Варбурга, можно исследовать активность более 100 ферментов.

Чтобы избежать необходимости измерять оптическую плотность растворов всегда в ультрафиолетовой области, применяют колориметрические методы. Образующийся в результате ферментативной реакции восстановленный НАД — НАД • Н₂ и НАДФ • Н₂ превращает специальное индикаторное веществе (например, формазан) в окрашенный продукт, количество кото­рого легко определять фотометрически в видимой области спек­тра. Примером этого может служить определение активности лактатдегидрогеназы:

Лактат НАД ФМС • Н ИНТ (НТБ) (бесцветный)

– ЛДГ –

Пируват НАД • Н₂ ФМС Фармазан (окрашенный)

Еще более удобны прямые колориметрические методы с использованием тио-НАД (ТНАД • Н) и тио-НАДФ (ТНАДФ • Н). При восстановлении этих окисленных форм производные никотинамидадениндинуклеотида окрашиваются в желтый цвет и мо­гут быть определены при длине волны 398 нм. [9, 21]

Рис. 2. Схема оптическая принципиальная КФК-2МП.

Схема оптическая принципиальная (рис. 2)

Нить лампы 1 (рис. 2) конденсором 2 изображается в плоскости диафрагмы 3 ( 2 мм). Это изображение объективом 4. 5 переносится в плоскость, отстоящую от объектива на расстоянии - 300 мм. с увеличением 10^х. Кювета 10 с исследуемым раствором вводится в световой пучок между защитными стеклами 9, 11. Для выделения узких участков спектра из сплошного спектра излучения лампы в колориметре предусмотрены цветные светофильтры 8.

Теплозащитные светофильтры 6 введены в световой пучок при работе в видимой области спектра 400—590 нм.

Для ослабления светового потока при работе в спектральном диапазоне 400—540 нм введены нейтральные светофильтры 7.

Пластина 14 делит световой поток на два: - 10% светового потока направляется на фотодиод ФД-24К (12) и – 90%—на фотоэлемент Ф-26 (15). Для уравнивания фототоков, снимаемых с фотоприемника ФД-24К при работе с различными цветными светофильтрами, перед ним установлен светофильтр 13 из цветного стекла СЗС-16.

При работе с кюветами 17 малой ёмкости в кюветное отделение устанавливается приставка 19 для микроанализа. Линзы 18 уменьшают диаметр светового пучка в месте установки микрокювет или пробирки. Линзы 16 восстанавливают световой пучок до первоначального диаметра.

Способы оценки результатов клинико-биохимического исследования на основании фотометрии продуктов реакции, высвобождаемых в конечной точке реакции и в ходе ее протекания.

Качество выполнения лабораторного исследования во многом определяется правильно выбранной и осуществленной методи­кой оценки полученных при работе с фотометрической аппарату­рой результатов. Она базируется на использовании градуировочного графика (таблицы), факторов пересчета, а также формулы, учитывающей значения абсорбции (экстинкции) и концентра­ции стандартных проб, обрабатываемых параллельно с опытны­ми в одинаковых с ними условиях.

Оценка результатов по калибровочной кривой

Градуировочная (калибровочная) кривая отражает тесную за­висимость между абсорбцией (А), называемой также оптической плотностью – О или экстинкцией – Е (либо, в отдельных случа­ях, интенсивностью излучения света: в процессе осуществления пламенной фотометрии, флюориметрии), и концентрацией (С) вещества в сериях стандартных растворов.

При построении градуировочного графика следует стремиться к тому, чтобы калибровочные растворы помимо стандартного ве­щества содержали если не все, то основные (сказывающиеся на течении реакции) компоненты биологической жидкости. Это достигается применением стандартных сывороток — водных рас­творов, содержащих и другие, способные интерферировать с оп­ределяемыми веществами ингредиенты плазмы: в количестве, примерно соответствующем таковому в исследуемой биологичес­кой жидкости. Так, например, при определении содержания билирубина в плазме (сыворотке) крови стандартные растворы дол­жны содержать белок (альбумин), поскольку он не только пре­дохраняет билирубин от окисления, но и усиливает интенсив­ность окраски получаемых в процессе реакции азопигментов. При определении концентрации ионов калия в плазме крови стандартные его растворы должны заключать в себе также ионы натрия и кальция (в концентрации, соответствующей содержа­нию этих ионов в анализируемой биологической жидкости), так как они влияют на интенсивность свечения ионов калия в пламе­ни газовой горелки пламенного фотометра.

Стандартные растворы должны готовиться с особой тщатель­ностью — из навески, полученной на весах для очень точного взвешивания (аналитических и других). При этом следует обра­тить внимание на то, чтобы стандартные вещества строго отвеча­ли своей химической формуле, имели высокую степень чистоты и достаточную стабильность, не были гигроскопичны и не вза­имодействовали с газами воздуха. Навеска должна быть достаточ­но большой — для уменьшения технической ошибки взвешива­ния. Этому способствует взвешивание стандартного вещества не в обычно тяжелом (массивном) бюксе, а на листочке целлофана (либо полиэтиленовой пленки) с последующим количественно полным перенесением вещества в соответствующую стеклянную мерную посуду. Как правило, перед взвешиванием оно должно быть высушено до постоянной массы в сушильном шкафу при 110°С.

Используемую для получения стандартных растворов градуировочную мерную посуду нужно предварительно тщательно обез­жирить и вымыть» Не рекомендуется сушить мерную посуду (в частности, мерные колбы) в сушильном шкафу, так как при вы­сокой температуре меняется ее объем и нарушается градуировка.

Построение калибровочной кривой начинается с приготовле­ния арифметического ряда разведений с последующей обработ­кой стандартных растворов аналогично опытным пробам.

Разведения стандартного вещества должны охватывать диапа­зон физиологических концентраций и выходить за пределы их минимальных и максимальных величин (до значений, могущих иметь место при встречающихся формах патологии). Так, напри­мер, при исследовании содержания общего белка в сыворотке (плазме) крови концентрация стандартного вещества (альбуми­на) должна быть в интервале от 40 до 120 г/л (при физиологичес­кой концентрации общего белка 65—85 г/л).

В большинстве случаев ряд калибровочных растворов получа­ют путем разбавления основного, маточного раствора (как это имеет место, например, при определении содержания общего белка плазмы или сыворотки крови).

Для каждой рабочей концентрации стандартного вещества нужно сделать 3—5 фотометрических или других (например, денситометрических) определений. Всего через методику проводят 2—3 серии окрашенных растворов, в результате чего обычно вы­полняется 6—12 исследований каждого рабочего разведения стандарта.

Суть построения градуировочной (калибровочной) кривой сводится к тому, что определенные объемы растворов серии стан­дартных проб обрабатываются в условиях, полностью идентич­ных таковым при анализировании исследуемого материала (опытных проб).

Измерения оптической плотности начинают со стандартного раствора наименьшей концентрации. Усредненные (соответству­ющие отдельным концентрациям) значения оптической плот­ности (абсорбции, экстинкции) наносят на миллиметровую (ка­либровочную) бумагу. На оси абсцисс (горизонтальной) с соблю­дением одинаковых интервалов в равномерно возрастающей концентрации откладывают показатели содержания вещества в стандартном растворе; на оси ординат (вертикальной) — соответ­ствующие им величины абсорбции. Зависимость между двумя сопоставляемыми величинами отражается линией, постро­енной уже по трем точкам замера. Однако строить калибровоч­ный график следует не менее чем по пяти точкам. Калибровочная кривая прокладывается (тонко отточенным карандашом, жела­тельно с помощью прозрачной линейки) таким образом, чтобы по возможности большее число точек (например, 3 из 5) лежало на линии, а остальные располагались близ нее, равномерно от­клоняясь в ту и другую стороны. Отдельные точки, значительно смещающиеся от калибровочной кривой и обычно являющиеся результатом грубой ошибки в определении, исключаются из уче­та. Точки принято обозначать крестиками (точка не имеет шири­ны). Оси координат начертают в виде толстых («жирных») отрез­ков прямой (со стрелками), на их фоне калибровочная кривая должна представлять собой тонкую линию.

. Схема построения калибровочной кривой

Расположение кривой определяют так, чтобы она исходила из нулевой отметки под углом 45^о к осям координат: при этом дос­тигается наибольшая точность измерений. Последней способ­ствует также выбор оптимального, достаточно крупного масштаба.

В правом верхнем углу листа с представленным на нем калиб­ровочным графиком приводят: наименование калибровочной кривой, ссылку на метод исследования (например, «ПАП»-метод определения содержания глюкозы в сыворотке крови), номер светофильтра (или его конкретную физическую характеристику: максимум пропускания), длину оптического пути кюветы (в мм), дату построения калибровочной (градуировочной) кривой. При этом учитывают, что у большинства обычных фотоэлектроколориметров наиболее благоприятная область измерений лежит в пределах 0,1—0.3 ед абсорбции (максимум до 0,7).

Для того чтобы правильно построить калибровочную кривую, необходимо знать, какие условия оказывают влияние на располо­жение линии в системе координат.

Если абсорбция опытной пробы оказывается не скорригированной на экстинкцию контрольной, то часто не удается достигнуть совпадения нулевого значения оптической плотности с ну­левым значением концентрации. Методы с таким построением калибровочного графика не рекомендуются для использования в клинико-диагностических лабораториях.

Известен ряд причин, вызывающих нарушение прямо про­порциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией вещества в растворах.

К ним относятся:

1) присутствие в среде посторонних электролитов, вызываю­щих деформацию молекул или комплексных ионов окрашенных веществ;

2) гидратация (сольватация), сказывающаяся на поглощении раствором светового потока: с изменением концентрации раство­ра этот процесс протекает неравнозначно;

3) неполное взаимодействие исследуемого вещества с реакти­вом при его разбавлении;

4) изменение взаимовлияния частиц при разбавлении раство­ра;

5) сдвиг рН раствора, влияющий на полноту образования и состав молекул окрашенного соединения;

6) изменение степени диссоциации вещества в растворе при разбавлении.

Основное значение в нарушении прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией имеет то обсто­ятельство, что сопровождающаяся образованием окрашенного соединения химическая реакция протекает не строго стехиометрично, т. с. реакция не всегда бывает полной. Примером этому служит взаимодействие аммиака с реактивом Несслера.

Кроме причин, связанных с состоянием вещества в растворе, ряд физических факторов, в частности недостаточная монохроматизация светового потока, способны вызвать отклонения в прямо пропорциональной зависимости между оптической плот­ностью и концентрацией. В случае если через абсорбируемый слой пропускается световой поток со значительным интервалом длин волн. то величина экстинкции может изменяться неравно­мерно с увеличением (уменьшением) толщины слоя раствора и концентрации вещества в нем, приводя тем самым к искривле­нию калибровочной линии.

Тем не менее констатируемое при построении калибровочной кривой отклонение от основного закона фотометрических опре­делений отнюдь не означает, что метод вовсе не пригоден для выполнения лабораторных исследований. В подобных ситуациях может быть применен комбинированный счетно-графический метод, суть которого сводится к выполнению как можно больше­го количества замеров оптической плотности, определению фак­тора пересчета (f) для каждой концентрации раствора (по формуле f = С/А) и построению калибровочного графика в системе ко­ординат «f» и «А». Значение f откладывают на оси абсцисс, а А — на оси ординат. Концентрацию анализируемой пробы находят путем умножения показателя ее экстинкции на найденный по ка­либровочной кривой фактор (С = f • А).

Построение простой калибровочной кривой и ее проверка

Для построения простой калибровочной кривой приготовляют 5 разных разведении из концентрированного (основного) стандартного раствора. Абсорбцию каждой пробы, включая «хо­лостую», определяют 3 раза. При этом в качестве раствора срав­нения используют воду или соответствующий растворитель. Для каждого из 6 троекратных определений (5 исследований раствора стандарта и одно — «холостой пробы») вычисляют средние вели­чины. Усредненный показатель «холостой пробы» вычитают из аналогичных величин стандартных проб.

Скорректированные таким образом средние значения абсор­бции располагают на оси ординат калибровочного графика (ве­личина экстинкции «холостой пробы» совпадает с нулевой точ­кой координат). Из соответствующих точек оси ординат проводят тонкие линии, параллельные «горизонтальной» оси (абсцисс).

На оси абсцисс наносят значения концентрации. Из получен­ных точек восстанавливают перпендикуляры и через места их пе­ресечений с перпендикулярами, восстановленными из соответ­ствующих точек оси ординат, проводят калибровочную кривую.

Для проверки простой калибровочной кривой раствор стандарта с третьей (в порядке возрастания) концентрацией оп­ределяется 20 раз и из 20 полученных величин вычисляют Х и S. После этого через «нулевую» точку и точку средней величины 20-кратного определения проводят прямую линию. Основные ка­либровочные точки должны быть расположены от этой прямой не дальше чем на ±1,2 S. Если это условие выполнено, то калиб­ровочная кривая может считаться прямолинейной и достаточно точной.

Точная калибровочная кривая

Для построения точной калибровочной кривой сначала стро­ят простую, однако в дополнение к 5 ее основным точкам нахо­дят:

1) точки, расположенные между «О» и нижней основной точ­кой и разделяющие этот участок эквивалентно (на равные отрез­ки);

2) необходимое дополнительное количество точек выше вер­хней основной точки.

Дополнительные калибровочные растворы следует анализи­ровать в одной серии с 5 основными. Далее следует осуществить проверку калибровочной кривой согласно описанию.

К построению точной калибровочной кривой можно перехо­дить лишь в том случае, если простая удовлетворяет всем предъ­являемым к ней требованиям.

Если точная калибровочная кривая обладает достаточно боль­шим пределом прямолинейности, то из показателей С и А, интег­рально отображенных точками, располагающимися на прямоли­нейном участке кривой, вычисляют калибровочный фактор.

8.18. рН-метрия и ионоселективный анализ: принцип метода, назначение.

Потенциометрические методы.

Потенциометрические методы основаны на измерении ЭДС, создаваемой электрохимическим элементом.

1) рh-метрия. Применяемое для измерения ph оборудование состоит из стеклянного электрода, электрода сравнения и pH-метра. Этот прибор широко применяется для приготовления буферных реакционных растворов, активности ферментов, электрофорезе белков сыворотки крови, определения ph слюны, мочи, желудочного сока.

1. Стеклянный (хлорсеребряный) электрод в растворе 0,1M HCl.

2. Электрод сравнения с солевым мостиком.

рН-метр.

2. Ион-селективные электроды.

Стеклянный электрод по сути дела является ион-селективным, т.к. он чувствителен к ио­нам водорода. В настоящее время имеются электроды, чувствительные к Са, Na, P, Cl, Mg, Fe и т.д. Определение их концентраций в крови, в экстрактах тканей может быть использовано в диагностике различных заболеваний. Например, при рахите в сыворотке крови уменьшается концентрация ионов кальция, а при кистозном фиброзе пот содержит избыток ионов хлора. При анализе золы волос больных И.Б.С. отмечено десятикратное уменьшение концентрации Са. [6], [19]

Ионометрическое (потенциометрическое) определение электролитов плазмы (сыворотки) крови и других биологических жидкостей.

Определение содержания в биологических жидкостях ионов Nа, К и С1 — одно из наиболее важных клинико-лабораторных исследований, составляющих основу не только обычного клинико-биохимического, но и неотложного анализа, выполнение ко­торого особенно необходимо больным, находящимся в критичес­ком состоянии.

Рядом существенных преимуществ перед колориметрическим и пламенно-фотометрическим способом определения электро­литов обладает потенциометрический метод анализа, основан­ный на измерении электрохимического потенциала ионоселективного электрода, погруженного в исследуемый раствор. Элек­трическая схема потенциометра включает в себя электрод сравнения (потенциал которого известен) и индикаторный (ионоселективный) электрод, потенциал которого измеряется. Значе­ния потенциала индикаторного электрода позволяют судить об активности присутствующих в растворе ионов: водорода, калия, натрия, лития, кальция и др.

Ионоселективные анализаторы — малогабаритные, настоль­ного расположения приборы, позволяющие устанавливать уро­вень свободных, не связанных с белком, а следовательно — фун­кционально активных ионов.

В настоящее время наиболее эффективным средством кон­троля ионного состава крови и других биологических жидкостей признаны автоматические и полуавтоматические анализаторы, в которых используются электрохимические датчики типа ионоселективных электродов. В зарубежных клиниках определение со­держания натрия, калия, хлорид-ионов практически полностью проводится с помощью таких анализаторов. К их числу, в час­тности, относятся: «Electrolite 2» («Бекман»), серия ионоселек-тивных анализаторов «Easylyte» («Medica»): «Easylyte»(«Easylyte Рlus», «Easylyte Lithium» – («Эко-Мед-Полл»), «Коне», полуавтома­тический калий-натриевый анализатор ОR-266, REAL-21 (с воз­можностью подключения к нему автоматического устройства по­дачи проб типа ОР-953) — фирмы «Раделкис», иономер ЭЦ-59 (микроанализатор ионоселективный К/Na, разработанный ТОО «Кварти-Мед» (Россия, г.Уфа). Сотрудниками кафедры аналити­ческой химии Белгосуниверситета, клинической лабораторной диагностики и ЦНИЛ БелГИУВ, ПО «Горизонт» осуществлена разработка (научные руководители проф. Е.М.Рахманько, В.С.Камышников) прямопокaзывающего анализатора ионного состава крови и других биологических жидкостей («АнИон»).

Анализаторы семейства «Easylyte» удобны в эксплуатации, в них используется диалоговый режим работы с прибором, предус­мотрена автоматическая калибровка, диагностика возможных неисправностей; осуществляется автоматическое вытирание заборника проб. Полуавтоанализатор может доукомплектовывать­ся пробоотборником, что превращает его в полный автоанализа­тор. Время анализа — 65—100 с для крови, 100 с — для мочи.

Микроанализатор ионоселективный ЭЦ-59 предназначен для быстрого и прямого определения концентрации калия и натрия в сыворотке или плазме крови. Управление работой прибора дос­тигается тремя кнопками. Калибровка полуавтоматическая: не­обходимые действия в виде подсказки отображаются на индика­торе, исключены ручные регулировки и ошибки оператора при калибровке. Время обработки пробы — 90 с. Индикатор результа­тов алфавитно-цифровой: с отображением концентрации изме­ряемых ионов.

Анализатор электролитов «АнИон» предназначается для од­новременного определения ионного состава (калия, натрия и хлора) крови и других биологических жидкостей. Объем исследу­емого образца — 250—300 мкл, относительная погрешность изме­рения — не более 3%, время одного определения — 30 с, диапазон измеряемых концентраций: для калия — 2—7 ммоль/л, натрия — 100— 170 ммоль/л, хлора — 80— 130 ммоль/л; количество одновре­менно измеряемых проб в автоматическом режиме — 10, количес­тво сохраняемых в памяти измерений — 54 последних. Использу­ется автоматическая калибровка, контроль по эталонному рас­твору и коррекция измеренных значений концентрации ионов. [6, 9]