8.19. Электрофорез: принцип метода, назначение.

Электрофорез – процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Явление электрофореза было обнаружено Рейссом в 1809 г. Исследователь наблюдал направленное движение к одному из электрических полюсов частичек глины, суспензия которой была помещена внутрь стеклянной трубки. В 1937 г. Тизелиус сконструировал аппарат для электрофореза, позволявший разделять белки на фракции в одной фазе (электрофорез в ванне, или свободный электрофорез). Однако этот прибор был дорог и не совершенен (после снятия подаваемого на электроды напряжения фракции вновь перемешивались), а все исследование сложно; по этим причинам метод электрофореза по Тизелиуса не вошел в повседневную практическую работу клинико-диагностических лабораторий. Лишь в 50-х годах нашего столетия для электрофореза белков плазмы крови был применен введенный Даррумом, Виланом и Фишером метод разделения на бумаге, получивший впоследствии весьма хорошее распространение (зонный или зональный электрофорез – т.е. электрофорез на поддерживающих средах-носителиях).

Зонный электрофорез можно осуществить с использованием смоченных буферным раствором (рН=8.6) полосок хроматографической бумаги, ацетат целлюлозной пленки, агарового геля и других носителей.

Если на электроды электрофоретической камеры, в которой размещены полоски носителя, подать напряжение, то в созданном таким образом электрическом поле ионы буфера и частицы нанесенного на полосу субстрата (сыворотки или плазмы) придут в состоянии направленного движения.

При нанесении у катода 20-100 мкл сыворотки белки крови заряженные отрицательно, устремляются к аноду со скоростью, зависящей от величины приложенного к электродам напряжения, заряда белков, их молекулярной массы, ph и ионной силы буфера. Заряд белков при этом может быть образован первично или вторично (в результате взаимодействия с буфером).

Для характеристики процесса электрофореза на носителе принято использовать понятия: падение напряжения на 1 см полосы (градиент потенциала) – В/см и силы тока, приходящаяся на 1см поперечного сечения полосы (плотность тока),- мА/см.

Под падением напряжения (градиентом потенциала) следует понимать распределение величины приложенного к электродам напряжения на всем расстоянии между электродами. Находится оно делением величины выходного напряжения (регистрируемого вольтметром источника постоянного напряжения) на расстояние между электродами, точнее – тот путь (в см), который преодолевают электрически заряженные частицы (ионы, электроны) от электрода к электроду. Так, если он составляет 30 см, а напряжение между электродами –150 В, то падение напряжения (градиент потенциала ) окажется равным частному от деления 150 на 30 , т.е. 5 В/см.

В зависимости от используемой величины падения напряжения различают: низко- (5-15), средне- (обычно 20-40) и высоковольтный ( превышающий 50 В/см) электрофорез .

Для расчета силы тока, приходящейся на 1 см поперечного сечения полосы, значение, «снимаемое» по показаниям миллиамперметра, делят на общую ширину всех полос носителя (ацетат-целлюлозной пленки, геля хроматографической бумаги).

Для создания идентичных условий разделения при проведении электрофореза на различных приборах, отличающихся размерами электрофоретической камеры, создают одинаковые величины градиента потенциала и плотности силы тока.

Высоковольтный электрофорез используется для разделения низкомолекулярных веществ, таких как аминокислоты и их производные, например конечные продукты разрушения катехоламинов и серотонина – ванилин-миндальная, гомованилиновая и 5-гидроксииндолуксусная кислоты. Различие в разряде и молекулярной массе подобных соединений слишком мало, чтобы при небольшом градиенте потенциала могло бы произойти эффективное разделение частиц. Однако высоковольтный электрофорез, примененный с выходным напряжением до 100 000 В, делает возможным фракционирование и таких соединений. Вследствие отмечаемого при высоковольтном электрофорезе значительного разогревания полос он требует специальных устройств и приспособлений для охлаждения бумажных лент. В случае использования высоковольтного электрофореза необходимо применение летучих буферов (растворов муравьиной, уксусной кислот, гидроксида аммония, пиридина и др.), которые при испарении не дают остатков солей(выкристаллизовавшиеся соли способствуют сгоранию полос), а также систем охлаждения , достигаемого либо охлаждением пластины, на которой лежат полосы, либо погружением полос бумаги в органический растворитель. Важно также исключить реофорез, который наиболее выражен при данном виде электрофореза.

Под реофорезом понимают перемещение по носителю анализируемых фракций белков, вызываемое испарением буферного раствора вследствие разогревания полос за счет выделений «джоулевого» тепла. Это испарение наиболее выражено в середине полосы, что и вызывает движение буферного раствора со стороны кюветных отделений к ее середине. Поскольку применяемая для электрофореза бумага является хроматографической, одни из белков более, другие менее прочно сорбируются поверхностью волоконец бумаги, в силу чего и происходит хромотографическое разделение. Было бы ошибочно полагать, что от реофореза следует всегда избавляться как от нежелательного явления. В конструкциях некоторых электрофоретических камер оно с успехом используется, повышая качество разделения фракций электрофоретическим методом.Но при применении высоковольтного электрофореза от реофореза всегда избавляются- прежде всего устранением того пространства, куда мог бы испаряться буферный раствор. С этой целью поверх полосок хроматографической бумаги укладывают полиэтиленовую пленку, а поверх её – тяжелую пластину, прижимающую бумагу к поверхности , охлаждаемой током воды.

Если бумага в электрофоретической камере располагается горизонтально, говорят о горизонтальном электрофорезе, а если вертикально или под углом к вертикали(горизонтали) – то о вертикальном электрофорезе.

Помимо аналитического электрофореза следует выделять электрофорез препаративный, предназначающийся для получения отдельных белковых фракций с целью последующего изучения их состава и свойств. В клинической химии обычно используется зонный аналитический электрофорез. К настоящему времени предложено множество различных систем для электрофореза. Несмотря на различие в конструкции и используемых носителях, общие требования к приборам и процессу проведения электрофореза одни и те же: описание их приведено в разделе, посвященном электрофорезу белков сыворотки крови.

Низковольтный электрофорез в отличие от высоковольтного используется для разделения высокомолекулярных соединений (белков, липопротеинов, гликопротеинов и других аналогичных).

Электрофорез на ацетатцеллюлозной пленке (см. примеры диагностики ЦГБ №6 ниже) проводится аналогично процедуре низковольтного электрофореза на бумаге. В настоящее время этот вид фракционирования (предложенный Коном, 1958) достаточно широко используется для исследования белкового спектра сыворотки крови пациентов.

Ацетатцеллюлозная пленка как носитель обладает рядом существенных преимуществ перед хроматографической бумагой: она химически однородна, имеет равномерную пористость, лишена эндоосмоса, быстро и хорошо смачивается водными растворами; ее волоконца, в отличие от хроматографической бумаги, не обладают способностью к адсорбции белковых молекул, что предотвращает появление «хвостов» и «размывание» промежутков между отдельными белковыми фракциями. Для постановки исследования достаточно 1-3 мкл сыворотки крови, время электрофороза по сравнению с фракционированием на хроматографической бумаге значительно сокращено.

Электрофорез на агаре. Гель агара, обладая меньшими сорбционными свойствами по отношению к белкам плазмы, чем бумага, создает лучшие возможности для их передвижения и фракционирования. При электрофорезе на агаре отчетливо выделяется множество различных фракций. Впервые этот вид электрофореза был предложен Гордоном с соавт. (1949).

В настоящее время метод электрофореза на агаре широко применяется при фракционировании белков и липопротеинов, для чего используют оборудование и расходные материалы фирмы «Бекман», а также поставляемые в Беларусь СП «Кормей-ДиАна» (система для электрофореза DS-2 и другие аналогичные). Процедура электрофоретического разделения принципиально не отличается от таковой на хроматографической бумаге и ацетатцеллюлозной пленке.

Иммуноэлектрофорез. Иммуноэлектрофорез, введенный Грабаром и Вильямсом в 1953 г., представляет собой своеобразную комбинацию электрофоретического и иммунологического фракционирования белков.

После завершения процедуры электрофореза белков в геле агара в узкий желобок, сформированной вблизи края его полосы (перпендикулярно разделенным фракциям) вносят антисыворотку к определенному виду белка и дают ей возможность диффундировать в геле агара. В месте контакта антисыворотки с электрофоретически разделенными белками образуются преципитационные дуги (вследствие образования комплекса «антиген-антитело»), характерные для отдельных видов белков.

При помощи этого метода удалось обнаружить более 25 различных фракций белков сыворотки крови.

В 1966 г. Laurell разработал усовершенствованный метод электроиммунодиффузии, получивший также название «ракетного» электрофореза за форму, которую приобретает преципитат в результате реакции «антиген-антитело», проходящей в геле.

Метод сходен с радиальной иммунодиффузией в том, что в нем также используют гель, содержащий антитела. Вдоль кромки слоя геля делают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал, например диск из фильтровальной бумаги диаметром 4 мм, обильно пропитанный кровью, после чего проводят электрофорез. При этом в слое геля создается электрическое поле, благодаря которому антиген входит в гель. Поскольку антигены обычно движутся значительно быстрее, чем антитела, но в одном направлении, реактанты продвигаются в геле вместе. Это позволяет пренебречь различиями в относительной молекулярной массе веществ и конфигурации неправильной формы, подобно тому, что происходит в ходе радиальной иммунодиффузии. Высота «ракеты», образующейся в ходе такой реакции, прямо пропорциональна концентрации антигена, она измеряется от верхней границы лунки до высоты пика.

Метод электроиммунодиффузии зарекомендовал себя как удобная и надежная система для определения альфа-фетопротеина в амниотической жидкости.

С помощью электроиммунодиффузии можно исследовать содержание разнообразных белков; однако одни из них требуют особых условий для вхождения в гель, другие – для образования видимого преципитата. Для усиления четкости проявления полос преципитации полоски геля помещают в растворы фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислоты.

Методу электроиммунодиффузии присущи и некоторые недостатки, типичные для многих методик электрофоретического фракционирования, в том числе большая длительность процедуры (составляющая от 2 до18 часов), малое количество исследований, выполняемых на полосе геля.

Капиллярный электрофорез. В настоящее время капиллярный электрофорез становится одним из наиболее распространенных аналитических инструментов фракционирования веществ в растворе.

Используемое для этой цели оборудование производится фирмами США («Эпплайд Биосистемс», «Спектрофизикс», «Бекман», «Био-Рад»), Франции, Швеции, Японии и некоторыми другими. Выпуск системы капиллярного электрофореза «Капель-103» освоен НПФ «Люмэкс» (г. С.-П.).

Процедура разделения веществ методом капиллярного электрофореза базируется на явлении миграции заряженных частиц в электрическом поле. [2, 4, 9, 16]