ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2007 г

Методическая разработка к практическому занятию № 3 (для преподавателей)

Факультет: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический.

Курс: 2

Семестр: 3

1. ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Механизм действия ферментов.

2. УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Сформировать у студентов представление о механизме действия ферментов, особенностях протекания ферментативных реакций.

3. ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

3.1. На примере истории развития теоретических представлений о механизме действия ферментов показать студентам логику развития биохимических исследований и формирования представлений в данной области энзимологии.

3.2. Сформировать у студентов представления о кинетике ферментативных реакций, обсудив совместно влияние различных факторов на скорость реакций, определение константы Михаэлиса и ее использование в клинико-диагностических целях.

3.3. Разобрать различные виды ингибирования активности ферментов.

3.4. Полученные теоретические представления закрепить в ходе выполнения лабораторной работы, изучив на практике влияние рН, температуры, активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы.

4. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЗАНЯТИЯ: 3 акад. часа.

5. МЕСТО ПРОВЕДЕНИЯ ЗАНЯТИЯ: учебная комната

6. ОСНАЩЕНИЕ ЗАНЯТИЯ

6.1. Набор для входного тест-контроля знаний студентов по теме: механизм действия ферментов.

6.2. Плакаты, иллюстрирующие механизм действия ферментов и ингибиторов ферментов.

6.3. Набор химических реактивов для исследования влияния рН на активность амилазы.

6.4. Набор химических реактивов для изучения влияния температуры на активность амилазы.

6.5. Набор химических реактивов для изучения влияния активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

6.6. Термостат, водяная и ледяная баня, химическая посуда.

6.7. Микрокалькулятор (приносят студенты).

7. ПЛАН ПРОВЕДЕНИЯ ЗАНЯТИЯ И БЮДЖЕТ УЧЕБНОГО ВРЕМЕНИ

7.1. Организационные вопросы – 3 мин.

7.2. Введение. Формулировка актуальности, цели и задач практического занятия – 8 мин.

7.3. Проведение тест – контроля исходного уровня знаний студентов – 15 мин.

7.4. Рассмотрение теоретических вопросов темы – 50 мин.

7.5. Перерыв – 10 мин.

7.6. Самостоятельное выполнение студентами лабораторной работы и составление отчета – 35 мин.

7.7. Обсуждение результатов практической работы и обобщение изученного на занятии теоретического материала. Подведение итогов занятия – 10 мин.

8. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ЗАНЯТИЯ.

Контрольные вопросы по теме занятия

8.1. Изложить кратко историю развития представлений о механизме действия ферментов.

8.2. Проанализируйте, каким образом, появление новых экспериментальных данных стимулировало развитие теоретических представлений.

8.3. Подтвердите, что общепринятая в настоящее время теория «переходных состояний» является не отрицанием ранее предложенных теорий, а их логическим развитием.

8.4. Можно ли утверждать, что существующее в настоящее время взгляды на механизм действия ферментов являются окончательными? Если нет, то в каком направлении, по вашему мнению, могут идти дальнейшие исследования в этой области?

8.5. Что изучает кинетика ферментативных реакций? В чем значение этих исследований?

8.6. Как зависит скорость ферментативной реакции от температуры и рН среды? Объяснить эти закономерности.

8.7. Как влияют концентрации субстрата и фермента на скорость реакций? Объяснить процессы, соответствующие отдельным участкам кривой субстратного насыщения.

8.8. Привести уравнение Михаэлиса-Ментен. Дать определение Кm.

8.9. Как определить Кm и Vмах по графику Лайнуивера-Бэрка?

8.10. Привести примеры использования Км в биохимических исследованиях и клинической диагностике.

8.11. Дать характеристику разным видам ингибирования, подтвердить примерами.

8.12. Каким образом по кривым субстратного насыщения и графикам Лайнуивера-Бэрка можно определить тип ингибирования?

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

Проблема строения и механизма действия ферментов насчитывает более 100 лет. Здесь будут рассмотрены лишь основные, этапные моменты ее развития.

Белковая природа ферментов была окончательно установлена лишь в 30-х годах 20 века. Поэтому все представления о механизме действия ферментов до этого времени основывались преимущественно на исследованиях гомогенного химического катализа. Повышение скорости химических реакций под действием ферментов объяснялось активацией субстрата в образующемся фермент-субстратном комплексе.

Для объяснения высокой специфичности ферментов по отношению к определенным субстратам Э. Фишер в 1894г выдвинул гипотезу о строгом соответствии геометрической формы субстрата и активного центра фермента. Согласно предложенной им модели субстрат и фермент должны подходить друг к другу как ключ к замку:

+

Большой вклад в изучение механизма действия ферментов внесли Л. Михаэлис и М. Ментен (1913г), которые изучая кинетику ферментативных реакций пришли к выводу о том, что они включают несколько основных этапов:

• Обратимое взаимодействие фермента с субстратом с образованием нестойкого фермент-субстратного комплекса;

• Преобразование субстрата в составе фермент-субстратного комплекса;

• Образование продуктов реакций, не обладающих сродством к ферменту, что способствует их освобождению: E + S ↔ E-S → E-P

Дальнейшим развитием теории Фишера явилось теория индуцированного (вынужденного) соответствия Д. Е. Кошланда (1959г), которая базировалась на данных исследований, включавших не только кинетический анализ, но и химическую модификацию радикалов аминокислот в молекуле фермента, ингибирование ферментов разными соединениями, изучение фермент-субстратных комплексов методами ренгено-структурного анализа, спектрографии и кристаллографии.

Согласно этой теории полное соответствие центра и субстрата наступает лишь в процессе взаимодействия фермента с субстратом, который вызывает (индуцирует) необходимые конформационные изменения фермента:

Гипотеза «индуцированного соответствия» предполагает существование между ферментом и субстратом не только геометрического, но и электростатического соответствия, обусловленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента, что является условием образования активного комплекса.

В настоящее время считается установленным, что «индуцированное соответствие» фермента и субстрата достигается не только за счет конформационных изменений фермента, но и сопровождается геометрической и электронной перестройкой субстрата.

Определенный вклад в развитие представлений о ферментативном катализе внесла кислотно-основная теория катализа. Но дальнейшие исследования показали, что подход к рассмотрению действия ферментов с позиций обычного кислотно-основного катализа является упрощенным. В активном центре фермента, как правило, наличествует несколько реакционных центров, поэтому более правильно подходить к оценке их действия с позиции полифункционального катализа.

Все эти выводы включает в себя современная теория промежуточных соединений, согласно которой фермент при взаимодействии с субстратом образует комплекс, в котором реакционная способность исходных компонентов выше, чем в нативном состоянии. Через ряд промежуточных соединений происходит превращение субстрата в продукты реакции, при этом могут реализоваться разные механизмы катализа (кислотно-основной, электрофильный, нуклеофильный).

E+S ↔ E-S ↔ [ES*] ↔ … ↔ E-P → E + P

комплекс пром. соед. комплекс