8.20. Автоматические анализаторы: принцип действия, назначение, достоинства.

Современные технологии автоматизированных клинико-биохимическах исследований на основе абсорбционного фотометрического анализа (биохимические полуавто- и автоанализаторы).

Одной из особенностей современной медицины является рас­ширение спектра и объема выполнения лабораторно-диагностических исследований. Это стало возможным благодаря разработ­ке новых, более информативных (по сравнению с ранее извес­тными) лабораторных тестов, а также автоматизации самой тех­нологической процедуры анализа при проведении клинико-биохимических, гематологических, общеклинических, иммунологических, гормональных исследований.

Практикуемый в большинстве ординарных клинико-диагностических лабораторий ручной (мануальный) метод анализа базируется на непосредственном участии лаборанта в осущест­влении всех основных этапов клинико-лабораторного исследова­ния: взятии биологического материала, реагентов, их смешива­нии, инкубации, регистрации аналитического сигнала (на фото­метре или другом приборе), расчете концентрации определяемо­го вещества. При этом даже незначительные отклонения в условиях выполнения анализа (неизбежно возникающие при постановке большого количества проб) способны существенно повлиять на конечный результат лабораторного исследования.

Стандартизация режимов определения, достигаемая автоматизацией всей процедуры анализа, естественно, повышает и на­дежность его выполнения, притом за более короткий период времени и с использованием значительно меньшего (чем при мануальном исследовании) объема реагентов и биологического мате­риала.

Основные принципы функционирования и типы технологичес­ких устройств, используемых для автоматизированного биохими­ческого исследования. Автоматизация биохимических исследований в мировой лабораторной практике началась приблизительно с середины 50-х годов нашего столетия. Первым толчком к её проведению послужило создание фотометров и спектрофотомет­ров с контролируемой температурой кюветы, так как это позво­лило реализовать на практике принцип кинетического исследо­вания субстратов, ферментов и других веществ. В дальнейшем эти аппараты стали наделять электронной функцией автомати­ческого перевода регистрируемых значений абсорбции в показа­тели концентрации или активности.

Появление автоматических фотометров, исключающих из практики оператора стадию расчетов, дало возможность проводить измерения не только в режиме конечной точки (когда ре­акция уже завершилась), но также в режиме:

- фиксированного времени (измерение результата через определенный интервал времени после начала реакции);

- кинетики (ряд измерений с определенным интервалом времени и расчетом активности фермента по средней величине изменения абсорбции за этот интервал времени);

- дифференциальном (расчет концентрации по разности абсорбции образца и «бланка»);

- бихроматическом (расчет концентрации по разности абсорбции, измеренной на двух длинах волн).

Дальнейшая автоматизация фотометров привела к появлению проточной кюветы, исключившей ошибки, связанные с поста­новкой кюветы в измерительный модуль и ее термостатированием, и позволяющей экономнее расходовать реактивы, поскольку при толщине поглощающего слоя 1 см объем кюветы составляет не более 100 мкл. С учетом объемов подводящих трубок и необхо­димости несколько раз менять реакционную смесь в кювете до начала измерения объем раствора, требуемый для проведения измерений, составляет 0,5—1,0 мл.

Наряду с одно- и двухканальными появились и многоканаль­ные фотометры, позволяющие измерять одновременно большое количество проб, что существенно ускорило процесс измерения.

Главным отличием автоматических фотометров (спектрофотометров) от автоанализаторов является необходимость вручную смешивать образец с реактивами. Поэтому, если укомплектовать автоматический фотометр устройством, автоматически смешива­ющим определенный объем пробы с определенным объемом ре­актива, такой комплекс может рассматриваться уже как автоана­лизатор.

Практически все автоматические фотометры снабжены программой внутреннего контроля (автоматически сообщают о возникших неисправностях) и имеют выход на компьютер. Число каналов программирования у подавляющего большинства авто­матических фотометров позволяет без перепрограммирования выполнять все биохимические исследования.

К наиболее распространенным фотометрам от­носятся следующие:

- КФК-2, КФК-3 — одноканальные фотометры без термостатирования кюветного отделения, позволяющие проводить прос­тейшие (метод конечной точки) исследования;

- одноканальный спектрофотометр фирмы «СОЛАР» РУ-1251 С. Комплектуется современным компьютером и проточной кю­ветой; можно использовать практически все современные ре­активы и методы исследования;

- одноканальный фотометр фирмы «Хоспитекс» Screen Master Plus; позволяет работать в режимах конечной точки (с линейной и нелинейной калибровкой), фиксированного времени и кинети­ки;

- одноканальный фотометр фирмы «Байер» RА-50. Может

снабжаться проточной кюветой; позволят проводить все современные определения;

- одноканальный фотометр фирмы «Эко-Мед-Полл» ЕРОLL-20. Делает возможным проводить все современные исследования;

- одноканальные фотометры фирмы «Кормэй» Соrmay Р1us, Сormay Multi. Имеют проточную кювету, которая при необходимости легко снимается. Измерения могут проводиться в пласти­ковых кюветах. Позволяет работать в режимах конечной точки

(со стандартом или фактором), фиксированного времени и кине­тики;

- одноканальные фотометры 4010 и 5010 фирмы «Бёрингер Маннгейм». Имеют проточную кювету, дают возможность про­водить все современные биохимические исследования;

- многоканальные фотометры фирмы «Лабсистемс» FР-900 (901, 901 М). Последние модификации снабжены компьютером. Все версии имеют не связанный с фотометром термостат-встряхиватель. Кюветы — оригинальной конструкции по 9 штук в обойме. Измерение вертикальное, поэтому очень важно иметь одинаковый объем раствора во всех кюветах;

- многоканальный фотометр фирмы «Сеак» СН-16, Позволяет проводить измерения в режимах конечной точки, фиксированно­го времени, кинетическом.

Техника автоматического лабораторного анализа к настояще­му времени достигла высокой степени совершенства. Разработа­но несколько десятков вариантов конструкции автоанализаторов для осуществления биохимических, гематологических и иммуно-химических исследований. Известные в мире биохимические автоанализаторы могут быть подразделены (несколько условно) на три основных типа.

1. Одноцелевые биохимические автоанализаторы, с помощью которых в анализируемой пробе определяется лишь один компо­нент биологической жидкости и ткани. К числу таковых могут быть отнесены, например, анализатор «Глюкоза-2» фирмы «Бекман», автоматическое устройство для определения уровня глюко­зы в сыворотке (плазме) крови германо-российского производ­ства (ЕSАТ-6660), автоматический титратор для определения со­держания кальция и т.д.

2. Автоматы для определения так называемых родственных компонентов. Это, например, автоанализатор аминокислот, принцип действия которого основан на хроматографическом их разделении (по Штейну и Муру); автоматический атомно-абсорбционный пламенный спектрофотометр.

3. Многоцелевые биохимические автоматические устройства, предназначающиеся для установления содержания в биологичес­ких жидкостях большого количества различных по химической природе компонентов, которые в лечебно-профилактических учреждениях наиболее широко применяются для вы­полнения ординарных и некоторых специальных клинико-лабораторных исследований.

Технико-аналитические возможности биохимических автоанализаторов во многом зависят от заложенного в них принципа действия: «поточного» или «дискретного» (см. рис. 5).

Принцип устройства и функционирования биохимических автоанализаторов.

Впервые поточный принцип действия автоанализатора был предложен Скеггсом (1954). Согласно этому принципу, все хими­ческие реакции при анализе проводятся в потоке транспортируе­мых по трубкам и разделенных воздушными прослойками проб.

Приборы такого типа («Техникон АА2») широко использовались в республиканских кардиологических центрах бывшего СССР для осуществления советско-американской программы проведения эпидемиологических исследований в области кардио­логии, а именно: для определения стандартизованными метода­ми содержания общего холестерола, холестерола липопротеинов высокой плотности, триацилглицеринов сыворотки крови.

Около 20 лет тому назад Я. Ружичка и Э. Хансен, К. Стюарт предложили новую разновидность непрерывного проточного анализа — проточно-инжекционный анализ (ПИА).

Особенностью его является введение (инжекция) определен­ного объема образца в непрерывный поток носителя. При большой скорости движения носителя, малом объеме анализируемой жидкости и достаточно узкой (капиллярной) трубке отдельные пробы не смешиваются друг с другом, а лишь немного разбавля­ются жидкостью-носителем. Это позволяет отказаться от разде­ления (сегментирования) жидкой зоны пузырьками воздуха (технологический принцип, используемый в автоанализаторах Скеггса).

Автоанализаторы, использующие дискретный принцип работы, применяются в клинико-лабораторной практике с начала 60-х годов XX в. Согласно этой технологии из специального пробо­отборника в реакционную емкость приготовителя вносятся ана­лизируемая проба, разбавитель (при необходимости) и соответ­ствующие реагенты. Смесь термостатируется, после чего замеря­ется се оптическая плотность (в видимой, ультрафиолетовой об­ласти). Возможно также использование других способов детек­тирования.

Основными узлами дискретных автоанализаторов являются: карусели (картриджи) с исследуемым биологическим материалом и реагентами, дозаторы (манипуляторы)» блок измерения кон­центрации определяемого компонента, регистрирующее устрой­ство и система управления комплексом перечисленных модулей.

В дискретных автоанализаторах вместо центрифугирования и диализа (традиционные процедуры предварительного отделения белков) используется большое разбавление проб, при котором помехи от присутствия белков в большинстве реакций становятся ничтожно малыми.

Именно этой технологии — создания автоматизированных ус­тройств дискретного типа в настоящее время придерживается большинство фирм, производящих автоанализаторы для клинико-биохимических исследований.

Своеобразным компромиссом, объединяющим проточный и дискретный принципы автоматизированного исследования, яв­ляется ротационная система, особенность которой состоит в использовании процесса центрифугирования. При этом смешива­ние пробы с реактивами, термостатирование и измерение вели­чины оптической плотности осуществляются во время вращения ротора центрифуги. В процессе центрифугирования жидкость перемещается по радиальным каналам ротора в соответствующие кюветы, вращающиеся совместно с ним.

Всем биохимическим автоанализаторам свойственны:

1) программное обеспечение, достигаемое использованием современной компьютерной техники (не микропроцессоров);

2) осуществление контроля за работой отдельных блоков при­бора и контроля качества проводимых лабораторных исследова­ний (в сооответствии с заложенной компьютерной программой);

3) автоматические пробоподготовка и дозирование.

Основные преимущества полностью автоматизированых устройств следующие.

1. Экономичность (экономное расходование реагентов). Если при работе на ФЭКе обычно требуется 3—4 мл реактива, то при выполнении исследований на автоанализаторе всего лишь 350— 500 мкл (и менее). Отсюда возможность 10-кратной экономии ре­агентов (!).

2. Использование весьма небольшого объема анализируемой

биологической жидкости (3—7 мкл).

3. Высокая производительность (до 800 и более исследований в час).

4. Достаточно большая загруженность. Автоанализатор дол­жен эксплуатироваться не менее 5—6 ч в сутки (!).

5. Гибкость в работе. Обеспечивается возможностью выполнения разных режимов определения: по конечной точке, двух- и многоточечной кинетике, с привлечением технологии турбидиметрии (иммунонефелометрии), ионометрии, поляризационной флюориметрии и др.

В последнее время используется принцип турбидиметрии с фиксированной абсорбцией. Особенностью этого технологичес­кого процесса является измерение времени прироста оптической плотности до заданного ее значения. Реализуется в коагулологии.

6. Возможность программирования автоанализатора под реактивы разных фирм-производителей, так называемая «открытость» системы, которая предполагает введение в компьютер веек необходимых параметров биохимической реакции и осуществле­ние самостоятельного программирования. Открытость системы имеет большое значение, так как стоимость одного биохимичес­кого исследования на 50% определяется использованными реа­гентами, на 30% стоимостью анализатора и на 20% — всеми ос­тальными затратами.

7. Применение небольших (в том числе и моющихся) измерительных кювет.

8. Системный подход, который расценивается как возмож­ность «просмотреть» сам ход реакции, что позволяет, в частности, выявить фазу исчерпания субстрата, кофакторов (при «ручном» определении это обнаружить невозможно).

9. Программное сохранение базы данных.

10. Возможность выполнения экстренных исследований (пос­тановки так называемых «цитовых» проб).

11. Связь с компьютерами: многие автоанализаторы имеют

выход на центральный, «хохстовый» компьютер.

12. Широкие возможности измерительного модуля. В отличие от обычных фотоэлектроколориметров, позволяющих замерять оптическую плотность растворов в пределах до 0,2—0,7 ед, современные биохимические автоанализаторы дают возможность регистрировать абсорбцию (при условии соблюдения закона Бугера—Ламберта—Беера) в диапазоне до 2,5 ед: это достигается ис­пользованием мощного источника облучения и более чувствительных приемников света.

Некоторые из современных биохимических автоанализаторов оснащены также ионоселективным блоком, позволяющим, в частности, проводить определения ионов валиномициновым мето­дом.

13. Использование неагрессивных жидкостей. Ферментные наборы реагентов не содержат агрессивных жидкостей, практи­чески не обладают токсическим эффектом.

14. Надежность устройства, связанная с применением в нем новейших технологий.

Классификация автоанализаторов. Единой классификации автоанализаторов к настоящему времени нет, В зависимости от конструктивных особенностей приборов и предоставляемых ими возможностей выполнения аналитических процедур все автома­тизированные устройства могут быть подразделены на несколько основных групп (классов).

1-й класс. Автоанализаторы, реализующие принцип «ВАТСН-системы», т.е. выполнения исследований «по тестам», или «по методикам» («от методики к методике»). Характерная конструк­тивная особенность их — использование проточных кювет. Ана­лизаторы этого типа предназначены для последовательного про­ведения отдельных серий исследований. Представляют собой от­крытые системы.

К ним относятся, в частности, автоматический биохимичес­кий анализатор «Autohumanalizer 900 S» фирмы «Хуман», «Vitalab Eclipse» фирмы «Мерк» и др.

2-й класс. Анализаторы селективные, обеспечивающие режим выполнения работы «по пациентам» — RANDOM. Позволяют исследовать различные биохимические тесты путем взятия (с применением манипулятора) отдельных аликвот одной и той же пробы биологического материала. Как правило, регистрация оптической плотности производится не в проточной, а в отдельной реакционной кювете. Приборы этого типа допускают возмож­ность проводить экспресс-анализы (STAT-режим: «внеочередно­го проведения анализа»).

К этой группе приборов относятся, в частности, «Cobas Mira»

фирмы «Хоффманн—Ла Рош», «SuperZet-818» фирмы «Мицубиси».

Ряд автоматизированных устройств этого класса могут обеспечивать приоритет выполнения проб с наименьшим числом за­казанных тестов — «TANDEM».

3-й класс. Многофункциональные интеллектуальные систе­мы. Предназначаются для использования в диагностических центрах, централизованных клинико-биохимических лабораториях. Содержат ионоселективные блоки.

К их числу относятся многоканальные биохимические автоанализаторы: «Boehringer Mannheim/Hitachi-911», «Нitachi-912» фирмы «Рош Диагностикc», «Spectrum» фирмы «Эбботт», «Sinchron» фирмы «Бекман».

Каждый из биохимических автоанализаторов характеризуется определенными технико-аналитическими возможностями. Они оцениваются следующими основными критериями:

1) спектр определяемых веществ: субстраты, ферменты, специфические белки, гормоны, электролиты, факторы свертыва­ния крови, иммуноглобулины, чужеродные соединения (нарко­тики, лекарственные вещества и др.);

2) производительность: количество исследований в час;

3) последовательность выполнения анализов: «от методики к методике», т.е. «по тестам» — ВАТСН или «по пациентам» — RANDOM;

4) открытость системы;

5) возможность выполнять биохимические исследования с использованием только одного реагента (монотесты) либо одного и большего их количества (требуемых для постановки конкретной методики). Хотя большинство биохимических реакций может протекать с одним реагентом, использование двух реактивов рас­ширяет возможности анализатора (позволяя, в частности, выпол­нять определение уровня билирубина, МВ-изофермента креатинкиназы);

6) объем биологической жидкости (мкл);

7) объем проточной кюветы (мкл);

8) объем реактива на одно исследование (мкл);

9) объем реакционной смеси (мкл);

10) необходимость в дополнительной очистке дистиллирован­ной воды;

11) особенности оптической системы регистрации:

а) источник света (ксеноновая, галогеновая лампа с длитель­ным сроком эксплуатации, лампа накаливания и др.);

б) диапазон длин волн;

в) монохроматизация светового потока: с помощью дифрак­ционной решетки, набора простых или интерференционных све­тофильтров;

г) система детектирования светового сигнала;

д) режим фотометрического измерения: монохроматический,

бихроматический;

12) используемый блок измерения (измерительный блок):

проточная кювета, сменные реакционные кюветы — одноразово­го, многоразового применения; моющиеся кварцевые кюветы;

13) характер измерения оптической плотности раствора, оценки результата:

а) по конечной точке;

б) по кинетике;

в) по двум точкам;

г) по фиксированной абсорбции;

д) возможность построения калибровочной кривой;

с) оценка результатов по нелинейной калибровке (иммуно-турбидиметрия);

14) реакционные кюветы: их количество, объем, материал, из которого изготовлены реакционные ячейки;

15) реагентные каналы: их количество (зависит ли от числа анализируемых проб);

16) дозатор (манипулятор) и особенности позирования биоло­гической жидкости и реагентов;

17) температурный режим: термостатированный измеритель­ный блок, термокювета и пр.;

18) устанавливаемая температура реакционной смеси: 37, 30, 25°С;

19) возможность охлаждать жидкие реагенты «на борту» авто­анализатора;

20) возможность разбавлять сыворотку;

21) возможность выполнять срочные («цитовые») исследова­ния;

22) особенности компьютерного обеспечения:

а) встроенная программа контроля качества, в том числе: оценка аналитической вариации с расчетом среднеквадратичного отклонения и коэффициента вариации на разных уровнях кон­центраций контрольных сывороток с иллюстрацией на графике Леви-Дженнингса; определение процента отклонения от линей­ности в измерениях по кинетике, калибровка по эталону для не­линейных реакций; контроль за пригодностью рабочих растворов реагентов по соответствию их оптической плотности значениям, указанным фирмой-изготовителем, за уровнем жидкости (ре­активов, сыворотки, мочи) в пробирках, возможность «чтения» штрих-кода и др.

Данное программное обеспечение сокращает время, затрачи­ваемое сотрудниками каждой лаборатории на составление отчет­ной документации и контрольных карт;

б) возможность вносить в компьютерную память автоанали­затора все необходимые параметры проведения биохимической реакции, а именно: сведения о длине волны, характере измере­ния, температурном режиме, значении эталона (или коэффици­енте), контроле на реактивы, пробе, продолжительности измере­ния, времени задержки, инкубационном периоде, объеме пробы и реагента и др.;

в) количество каналов программирования;

г) объем памяти для программирования биохимических ре­акций;

д) возможность архивировать данные (сведения о больных);

е) связь с внешним компьютером;

23) печатающее устройство (принтер встроенный или внеш­ний);

24) используемая бумага (обычная, термобумага);

25) необходимость применения кондиционера;

26) шумовые эффекты;

27) необходимость стабилизации напряжения;

28) габариты прибора;

29) масса прибора;

30) цена (ПЗО).

В зависимости от потенциальных возможностей приборов биохимические автоанализаторы подразделяют на:

1) малые (обладающие производительностью примерно 100— 120 анализов/ч);

2) средние (180—250 анализов/ч);

3) современные большие многоканальные (позволяющие выпол­нять 400—600—800 и более анализов/ч).

В зависимости от габаритов и массы приборов различают:

1) настольные автоанализаторы (малогабаритные приборы, не требующие дополнительной водоподготовки);

2) напольные автоанализаторы с системой водоочистки (иногда нуждающиеся в расположении в отдельной комнате, оснащенной кондиционером).

Взаимосвязь работы кафедры биохимии УрГМА и ЦГБ №6.

Результаты научных исследований кафедры биохимии востребованы в практическом здравоохранении. Отделение лабораторной диагностики ЦГБ № 6 много лет проводит исследование липидного спектра у больных с различной патологией, внедрено исследование апобелков А-1 и В иммунотурбидиметрическим методом с наборами фирмы Spinreact, проводится типирование дислипопротеидемий.

Внедряются такие современные исследования, как определение перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты. Благодаря работам Мещанинова В.Н. (докторская диссертация) и аспиранта Щербакова Д.Л. совместно с доцентом кафедры внутренних болезней №2 Думаном В.Л, в лабораторном отделении освоен хемилюминометр «Конструктор» (г. Нижний Новгород) для определения ПОЛ разных биологических жидкостей и клеток больных с нефропатологией.