Рефрижераторные высокоскоростные центрифуги

№	число оборотов, время	органеллы	объект
1	3000 об/мин, 5 мин	Ядра, интактные клетки	ДНК, РНК, ферменты синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований.
2	10000 об/мин, 10 мин	Митохондрии	Ферменты тканевого дыхания, ЦТК, окисления жирных кислот. Цитохромоксидаза. Моноаминооксидаза.
3	постмитохондриальная фракция	Цитозольная фракция	Ферменты гликолиза, ПФП, синтеза холестерина, жирных кислот.
4	40000-70000 об/мин, 60 мин	Лизосомы	Кислые гидролазы или катепсины.
5	100000 об/мин, 90 мин	Рибосомы, микросомы	РНК-рибосомальная, трансляция белка, цитохром Р450, глюкозо-6-фосфотаза

Клеточные органеллы, полученные для изучения активности ферментов, с целью увели­чения их проницаемости и доступности фермента и субстрата подвергают 2-3 кратному за­мораживанию-оттаиванию, добавлению ПАВ, обработке ультразвуком. [5, 6, 10]

8.12. Метод гомогенизирования, причины, назначение. Приготовление гомогенатов тканей и органов.

Гомогенизация приводит к потере морфологических и биохимических свойств, характерной для данной ткани. Такая потеря не существенна, если гомогенизация проводиться как предварительная стадия выделения из ткани какого-либо химического соединения.

Однако в тех случаях, когда изучают метаболические процессы, морфологическая и биохимическая целостность ткани должна быть сохранена в максимальной степени. Целью гомогенизации, которая, к сожалению, по-прежнему остается эмпирическим методом, является разрушение ткани, клеточных стенок и (или) мембран и высвобождение клеточного содержимого. Для этого применяются самые разнообразные методы и приборы, хотя лежащие в их основе принципы не всегда ясны. Лишенная прочной теоретической базы и необходимого арсенала стандартных методов, гомогенизация представляет собой скорее искусство, чем наука. В силу того, что различные ткани в значительной степени отличаются одна от другой как по хрупкости определенных клеточных органелл, так и по устойчивости клеток и тканей к разрушению, при гомогенизации любого биологического материала всякий раз неизбежно возникают специфические проблемы, которые можно разрешить только путем проб и ошибок. В основном гомогенизация применяется как стадия, предшествующая разделению клеточных компонентов, которая дает возможность установить внутриклеточную локализацию метаболических процессов. Гомогенаты успешно используются и при изучении поглощения и метаболизма соединений в тех случаях, когда доставка их в интактные клетки затруднена в силу недостаточной проницаемости мембран. [4]

Для постановки диагноза и дифференциальной диагностики заболеваний в ряде случаев прибегают к биохимическому анализу пунктатов тканей. С этой целью навеску ткани (например, печени) измельчают в соответствующем объёме жидкости, приготовляя из неё гомогенат или экстракт – вытяжку. Для получения гомогенатов используют растворы следующего состава: 0,25 моль/л сахарозы; 0,25 моль/л сахарозы, содержащей 1 ммоль/л ЭДТА; 0,44 моль/л сахарозы; 0,88 моль/л сахарозы; 9 г/л NaCl и др. Экстракт готовят с применением растворов KCl и NaCl различной концентрации, буферных растворов, бидистиллированной воды. Обломки субклеточных структур отделяют с помощью центрифугирования на сверхскоростных центрифугах при 18000 об/мин в течении 30 мин.

Следует различать два типа гомогенатов: с разрушенными и c неразрушенными клеточными органеллами.

Для приготовления гомогенатов первого типа используют жесткие методы гомогенизации (состоящие в применении макро- и микрогомогенизаторов Уорринга, ступок с кварцевым песком). Гомогенаты с неразрушенными субклеточными структурами получают применением щадящих методов гомогенизации – стеклянных гомогенизаторов с тефлоновыми пестиками типа Поттера и Даунса. Помещая стаканы этих гомогенизаторов в баню со льдом, измельчают ткань при вращении пестика со скоростью 800-1000 об/мин в течении 30-90 с в гомогенизаторе Поттера или при многократном движении пестика вверх и вниз в гомогенизаторе Даунса. Приготовленные таким образом гомогенаты пригодны для проведения биохимического исследования субклеточных структур.

Полученные в мягких условиях (например, с применением гомогенизаторов Поттера) гомогенаты второго типа можно превращать в гомогенаты с разрушенными клеточными органеллами путем повторения процедур замораживания и оттаивания, добавления поверхностно –активных веществ, обработку ультразвуком.