2. Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний (днк-зондирование, пцр). Их принцип, область применения.

Молекулярно-генетическими методами в исследуемом материале обнаруживают нуклеотидные последовательности ДНК-возбудителя. К ним относятся метод ДНК-гибридизации и полимеразная цепная реакция.

Метод ДНК- гибридизации основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК возбудителя достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют ДНК-зонды. Это лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомого возбудителя. Зонд метят либо радиоактивным изотопом, либо ферментом. В последнем случае для регистрации включения ДНК-зонда в ДНК бактерий, содержащуюся в исследуемом материале, к пробе добавляют субстрат, соответствующий использованному ферменту. Положительная реакция субстрат-фермент проявляется в изменении окраски субстрата и свидетельствует о соответствии ДНК-зонда ДНК возбудителя, находящейся в исследуемом материале. Чувствительность метода уступает ПЦР, что ограничивает его применение как диагностического теста, тем более что аналогичную чувствительность имеют иммунологические методы, выявляющие микробные антигены.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой метод направленной амплификации (воспроизведения) ДНК, позволяющий найти в исследуемом клиническом материале небольшие участки генетической информации любого организма и многократно размножить их. Для реализации ПЦР создают набор праймеров - фрагментов ДНК, являющихся маркером данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшийся двунитевой стартовый участок воспроизводится с помощью фермента Taq-полимеразы, входящей в набор для ПЦР. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и т. д. Это и есть цепная реакция. В течение нескольких часов происходит 30-40 циклов амплификации. В результате амплификации количество копий специфической нуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 106-108 раз, что обеспечивает высокую чувствительность метода.

Преимущества молекулярно-генетических методов диагностики состоят в их высокой специфичности и чувствительности. Они позволяют обнаруживать в исследуемом материале единичные клетки возбудителя.

ПЦР имеет три технологические стадии:

• выделение и экстракция ДНК (пробоподготовка);

• амплификация;

• регистрация результатов амплификации.

Достоинства ПЦР:

1. высокая чувствительность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток в

пробе;

2. высокая специфичность — в исследуемом материале выявляют уникальный для

данного возбудителя фрагмент ДНК;

3. универсальность процедуры выявления различных возбудителей, что даёт

возможность диагностировать несколько возбудителей в одной биопробе;

4. высокая скорость анализа — унифицированная обработка биоматериала и детекция

продуктов реакции, а также автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 ч;

5. возможность проводить количественный анализ и определять число копий специфических последовательностей нуклеотидов в пробе, контролируя таким образом вирусемию или бактериемию (например, вирусную нагрузку при вирусных гепатитах или ВИЧ-инфекции);

6. возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. ПЦР можно

эффективно использовать для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, её использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Метод ПЦР имеет свои ограничения, в частности, для диагностики инфекций,

вызванных условно-патогенной микрофлорой. Высокая чувствительность ПЦР создаёт

опасность получения ложноположительных результатов за счёт минимальных

загрязнений ДНК окружающей среды лабораторий, регулярно выполняющих однотипные

исследования. Это формирует строгие требования к режиму проведения анализа.

3. Условно-патогенные микроорганизмы, их общая характеристика. Условия возникновения гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой. Методы микробиологической диагностики.

Условно-патогенные микроорганизмы:

• Обитают в организме человека

• Встречаются в организме животных и во внешней среде

• Заселяют различные биотопы человека – органы и системы организма человека, сообщающиеся с внешней средой

• Формируются экологические взаимоотношения между организмом и нормофлорой, а

также – между представителями нормофлоры данного биотопа

• Видовой и количественный состав нормофлоры регулируется условиями:

1. Наличием субстрата, кислорода, рН и пр.

2. Механизмами неспецифической и специфической защиты (иммунитет)

Условия, способствующие реализации патогенного потенциала условно-патогенными

бактериями:

• Снижение уровня иммунной защиты

• Смена биотопа

• Увеличение количества (концентрации) микроорганизмов в биотопе

Исходя из данных условий, условно-патогенные микроорганизмы, как правило, являются

причиной госпитальных инфекций, входящих в структуру внутрибольничных инфекций.

Особенностью бактериологического исследования патологического материала,

содержащего нормальную микрофлору (молоко, моча, мокрота) при гнойно-воспалительных заболеваниях, вызванных условно-патогенными бактериями, является использование количественных методик. Данные методики разработаны для всех видов патологического материала и позволяют учитывать количество (концентрацию) выделенных микроорганизмов. Концентрация условно-патогенных микроорганизмов в патологическом материале позволяет рассматривать их в роли возбудителя.

Внутрибольничные инфекции:

Любое, клинически распознаваемое инфекционное заболевание, поражающее больного в

результате госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также персонал, независимо от того, проявлялось ли оно при нахождении в стационаре.

Практическое значение внутрибольничных инфекций:

1. Удлинение сроков лечения

2. Увеличение доли инвалидизации

3. Рост смертности

4. Экономический ущерб: оплата больничных листов, оплата инвалидности, оплата

лечебных процедур и лекарственных средств и пр.

Причины и условия возникновения ВБИ:

1. Нарушение правил асептики или недостаточность асептических мероприятий:

а) неграмотность, небрежность, нехватка медицинского персонала;

б) старые помещения, старое оборудование

в) неадекватные методы стерилизации сложного медицинского оборудования

г) вентиляция

2. Высокая вероятность контакта больных и персонала: скученность пациентов, нехватка персонала

3. Массовая госпитализация: до 25% населения госпитализируется 1 раз в год

4. Инвазивные методы обследования и лечения: создание искусственных «входных ворот»;

до 30% манипуляций не обоснована

5. Снижение резистентности организма пациентов

6.Циркуляция госпитальных штаммов: высоковирулентных и полирезистентных

Условия селекции:

а) снижение резистентности организма

б) нерациональная антибиотикотерапия; использование антисептиков, дезинфектантов

Основа селекции:

а) гетерогенность микробной популяции

б) R-плазмиды

Источники ВБИ

1. Больные

2. Медицинский персонал

3. Внешняя среда стационара (лечебно-диагностического учреждения)

4. Посетители

Механизмы и пути распространения ВБИ

1. Аэрогенный: воздушно-капельный, воздушно-пылевой

2. Фекально-оральный: водный, пищевой, контактно-бытовой

3. Контактный: непосредственный контакт

4. Артифициальный (искусственный) – в основе его лежит преодоление микроорганизмами естественных защитных барьеров:

• Контактно-инструментальный

• Инъекционный, инфузионный

• Трансфузионный

• Имплантационный

• Посткатетеризационный

• Ингаляционный

Этиология ВБИ:

Все известные инфекционные агенты: бактерии, вирусы

*** респираторные (грипп, ветрянка и пр.)

*** кишечные (особенно у детей младшего возраста)

Условно-патогенные микроорганизмы: представители нормальной микрофлоры

Госпитальные инфекции: Входят в структуру ВБИ

Этиология: условно-патогенные микроорганизмы – высоковирулентные и полирезистентные (энтеробактерии, НГОБы, стафило- и стрептококки, дифтероиды и облигатные анаэробы)

Эпидемиология: чаще всего механизм распространения – артифициальный

Клинические проявления госпитальных инфекций

• гнойно-септические (гнойно-воспалительные) процессы (85%)

• диареи, особенно в детских стационарах

• пневмонии

• мочевая инфекция

• сепсис

Принципы диагностики госпитальных инфекций:

I. Факт госпитальной инфекции: наличие не менее 3 пациентов в очаге

II. Выделение и идентификация возбудителя

III. Выявление источников инфекции:

1) обследование персонала; обследование объектов среды стационара, инструментов

2) фаготипирование, бактерцинотипирование

IV. Выявление маркеров госпитализма: резистентности к антибиотикам (выявление бета-

лактамаз); плазмидный профиль, ДНК- гомология

Принципы профилактики госпитальных инфекций

• Рациональная антибиотикотерапия

• Мониторинг резистентной микрофлоры в лечебном учреждении

• Целесообразность инвазивных манипуляций

• Строгое соблюдение правил асептики

• Санация носителей (сотрудников и пациентов перед операцией)

• Вакцинация пациентов перед плановыми операциями

4. Синегнойная палочка, классификация ее свойства, факторы патогенности, токсины и ферменты. Заболевания, вызываемые синегнойной палочкой, лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и терапия, рациональная антибиотикотерапия.