- •Диагностические сыворотки
- •И их применение
- •В микробиологической практике
- •Методические рекомендации
- •Методические рекомендации
- •1. Классификация диагностических сывороток
- •2. Отбор животных-продуцентов и гипериммунизация
- •3. Приготовление диагностических сывороток
- •3.1. Агглютинирующие сыворотки, их приготовление и применение
- •3.2. Преципитирующие сыворотки, их приготовление и применение
- •3.3. Диагностические сыворотки для постановки реакции связывания комплемента, их приготовление и применение
- •3.4. Антитоксические сыворотки для постановки реакции нейтрализации
- •3.5. Приготовление и применение флуоресцирующих сывороток
- •При люминесцентной микроскопии
- •3.6. Моноклональные антитела и их получение
- •4. Общие сведения о гамма-глобулинах и способы их получениия
- •Риваноловым методом
- •На показатель преломления и процент белка по Рейссу
- •5. Термины и определения
- •6. Список использованной литературы
- •Содержание
При люминесцентной микроскопии
На рис. 14 представлена схема получения флуоресцирующей сыворотки.
-
Подготовка антигенов
Подготовка кроликов
-
Гипериммунизация кроликов
-
Тотальное взятие крови
-
Получение сыворотки
-
Высаливание глобулинов сульфатом аммония
-
Очистка глобулинов от сульфата аммония
-
М ечение глобулинов флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ)
-
Удаление избытка флуорохрома
-
Консервирование препарата
-
Расфасовка, лиофильная сушка
-
Упаковка, маркировка, контроль
Рис. 14. Технология приготовления флуоресцирующих сывороток
Кроликов иммунизируют многократно инактивированными антигенами и получают сыворотку крови с титром антител не ниже 1:6400-1:12800. Из сыворотки осаждают глобулины сульфатом аммония. Очищенный глобулин метят ФИТЦ. Меченые глобулины консервируют мертиолятом, разливают в ампулы, лиофилизируют и проводят контроль качества.
Флуоресцирующие сыворотки (глобулины) проверяют на активность (красящий титр) и на специфичность.
Их используют для экспресс-диагностики инфекционных болезней в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) – метод флуоресцирующих антител (МФА).
Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.
Разработаны прямой и непрямой варианты РИФ.
Метод прямой РИФ — антиген связывается с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (рис. 15).
Рис. 15. Прямая реакция иммунофлуоресценции
Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора.
На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки (в случае непрямой РИФ, сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.
Метод непрямой иммунофлуоресценции - антиген связывается с неконъюгированным специфическим антителом (первичным антителом). Флуоресцентная метка конъюгирована со вторичным антителом, специфичным к первичному антителу.
Образуется комплекс «антиген-антитело-антитело» (рис. 16).
Рис. 16. Непрямая реакция иммунофлуоресценции
Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для обнаружения антител в сыворотке крови больного животного.
В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной сывороткой против специфических антител (анти-антитела). В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение комплекса «антиген-антитело-антитело».