3.6. Моноклональные антитела и их получение

Моноклональные антитела (МКА) - это гомогенные (однотипные) ан­титела, синтезируемые гибридомными клетками, сочетающими способ­ность синтеза специфических иммуноглобулинов одного эпитопа с неограниченной пролиферацией (размноже­нием).

МКА широко применяются для диагностики инфекционных болезней. На их основе разработаны тест-системы для иммуноферментного ана­лиза (ИФА) и РИФ.

Моноклональные антитела впервые были получены в 1975 г. англий­скими учёными Келлером Г. и Милштейном Ц.

В основу метода получения МКА положена способность нор­мальных плазматических клеток (сенсибилизированные В-лимфоциты, сплено­циты) сохранять продукцию антител in vitro после слияния с перевивае­мыми опухолевыми клетками (миеломные клетки – злокачественно пе­рерожденные В-лимфоциты, плазмоцитомы). В результате образуется популяция гибридных клеток (гибридом), которой плазматические клетки передали способность вырабатывать специфические антитела, а мие­ломные - способность к неограниченному росту («бессмертие»).

Рис. 17. Схема получения моноклональных антител

(АОК – антителообразующие клетки, Пл – плазмоцитомы)

В настоящее время предложе­но несколько модификаций метода по­лучения гибридом, но все они сводятся в целом к проведению следую­щих этапов:

- иммунизация животных;

- слияние иммунных лимфоцитов животных с миеломными клетками;

- селекция гибридных клеток;

- наращивание клонов и скрининг их на способность продуциро­вать специфические антитела;

- клонирование гибридом и наращивание клонов гибридом в культуре и организме сингенных мышей;

- изучение свойств полученных МКА.

Российскими учеными (Телер Л.А., Погуляева Л.В., Ходун Л.М., 1996) получены моноклональные антитела, специфично взаимо­действующие с поверхностными антигенами микобактерий туберкулёза бычьего вида, и на их основе разра­ботана иммуноферментная тест-система для прове­дения идентификации мико­бактерий туберкулёза бычьего вида и диф­ференциации их от микобактерий человеческого вида и атипичных, медленно растущих микобактерий.

4. Общие сведения о гамма-глобулинах и способы их получениия

При диагностике ряда инфекционных болезней используются глобу­линовые препараты, которые получают из сыворотки крови гиперимму­низированных животных путем удаления из нее балластных белков, не участвующих в иммунном ответе организма.

Кровь состоит из жидкой части - плазмы и форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов.

Плазма крови, лишенная белка фибриногена и форменных элемен­тов, называется сывороткой крови.

Белки плазмы, которые остались после удаления фибриногена, на­зываются сывороточными белками. Известно около 100 белковых ком­понентов плазмы. Условно их можно разделить на три группы:

- альбумины

- глобулины

- фибриноген.

Глобулины сыворотки крови делятся на три фракции: α, β, γ- глобу­лины. Каждая фракция, в свою очередь, делится на подфракции. Разде­ление основано на их различной электрофоретической подвижности.

Альфа-глобулины (α-глобулин) - фракция глобулинов сыворотки крови, состоящая из гликопротеидов и липопротеидов, обладающая наибольшей электрофоретической подвижностью (в сравнении с дру­гими фракциями); участвует в транспорте липидов.

Бета-глобулины (β-глобулин) - фракция глобулинов сыворотки крови, состоящая из гликопротеидов, липопротеидов и металлопротеидов (трансферрин, церулоплазмин), обладающая средней между фракциями альфа- и гамма-глобулинов электрофоретической подвижностью; участвует в транспорте комплемента и некоторых антител.

Гамма-глобулин (γ-глобулин) - фракция глобулинов сыворотки крови, которая выполняет функцию защитных антител в организме и об­ладает наименьшей электрофоретической подвижностью.

Впервые выделены из сыворотки крови Тизелиусом А. в 1937 г.

Из белковых фракций сыворотки крови гамма-глобулиновая явля­ется самой неоднородной (имеется более 16 подфракций). Однако все подфракции гамма-глобулина очень близки по физико-химическим свой-ствам и электрофоретической подвижности.

По форме частиц гамма-глобулин относится к глобулярным белкам, форма которых приближается к сферической (рис. 18).

Рис. 18. Комплекс «антиген-антитело»

(микроорганизм в центре, вокруг него - иммуноглобулины)

Содержание гамма-глобулина в сыворотке крови животных различно и непостоянно. Особенно изменяется содержание гамма-глобулинов и белкового спектра сыворотки крови, в целом, при различных инфекцион­ных заболеваниях. Этот фактор является одним из диагностических при­знаков. Значительно увеличивается содержание гамма-глобулина при иммунизации животных под воздействием введенного антигена.

У молодых особей содержание гамма-глобулина значительно ниже, чем у взрослых, а у новорожденных он отсутствует совсем.

Так, например, в плазме новорождённого жеребёнка содержится 3,7 % белка, из них альбумина – 65 %, альфа-глобулина –32 %, бета-глобу­лина –3 %, а гамма-глобулина –0 %.

Гамма-глобулин отсутствует и в сыворотке крови новорождённого те­лёнка, однако, через 18-20 часов после дачи молозива его содержание можно обнаружить биохимическими методами.

Гамма-глобулины у поросят попадают в сыворотку крови только из молока матери. Через 3 недели после рождения поросята начинают са­мостоятельно продуцировать сывороточный гамма-глобулин.

Таблица 2. Содержание белковых фракций в сыворотке крови

Объект	Белковые фракции, %
	альбумины	Глобулины
		альфа	бета	гамма
Человек Корова Лошадь Свинья Овца Кролик Морская свинка	55.2 41.0 32.0 42.0 57.0 60.0 56.0	5.3 13.0 14.0 16.0 11.0 7.0 14.5	8.7 8.0 24.0 17.0 7.0 12.0 8.0	30.0 38.0 30.0 25.0 25.0 21.0 21.5

Известно пять классов гамма-глобулинов (иммуноглобулинов):

1. Jg G - доминируют в сыворотке крови при инфекционных болез­нях. Относятся к поздним микроглобулинам. Молекулярная масса - 150 тыс. Д, период полужизни – 12-20 дней. На долю Jg G от всех классов иммуноглобулинов приходится 85%. В сыворотке крови Jg G - 10-25%. Особенно активны против грамотрицательных бактерий и токси­нов. Единственные иммуноглобулины, проходящие через плаценту.

2. Jg M - при заражении появляются в сыворотке крови первыми, на ранних стадиях иммунного ответа. Относятся к ранним макроглобулинам. Молекулярная масса - 970 тыс. Д, период полужизни – 5 дней. В сыворотке крови животных - 6%. Эволюционно старейшие антитела, лизируют антигены совместно с комплементом.

3. Jg А - сывороточный и секреторный. Основной класс антител в секре­тах. Секреторный Jg А препятствует проникновению возбудителей инфекционных болезней в организм через слизистые обо­лочки, ингибирует колонизацию эпителия бактериями. Обеспечивает первую линию защиты. Период полужизни – 6 дней, в сыворотке крови 10-13%.

4. Jg D - найдены у людей, больных красной волчанкой, дифтерией, ревматиз­мом. Связываются с В-лимфоцитами, выполняет регулирующую функцию. В сыворотке крови до 0, 03%. Короткоживущие иммуноглобулины.

5. Jg E (реагины) - обнаруживают при аллергиях. Связываются с тучными клетками и базофилами, стимулируют их дегрануляцию. В сыворотке крови до 0, 001%.

Иммуноглобулины по химическому составу относятся к гликопротеи­дам с молекулярной массой 150-900 кД, содержат около 10 % углеводов, состоят из 18 аминокислот (рис. 19).

Рис. 19. Строение молекулы Jg G

Электрофоретически гомогенная масса гамма-глобулина сыворотки крови обычно состоит из JgG, JgЕ, JgM, поэтому ее называют общей гаммаглобулиновой или иммуноглобулиновой фракцией сыворотки крови.

Установление связи антител с гамма-глобулиновой фракцией сыво­ротки кpoви послужило стимулом для разработки методов её выделения с целью применения в клинической практике и изучения физико-химиче­ских свойств.

К настоящему времени известно большое число различных методов фракционирования сывороточных белков - химических, физических и физико-химических.

К химическим и физико-химическим методам относятся:

- высаливание нейтральными солями - сернокислым аммонием, хло­ристым натрием, сернокислым натрием и некоторыми другими;

- изоэлектрическое осаждение;

- разведение с изменением ионной силы раствора;

- фракционирование при помощи органических осадителей - этило­вого и метилового спирта, ацетона, эфира;

- осаждение при помощи катионов - неорганических и органических (риванол) металлов;

- осаждение при помощи анионов;

- применение ионообменных смол.

К физическим методам относятся:

- ультрафильтрация через полупроницаемые мембраны;

- ультрацентрифугирование;

- разделение белков методом хроматографии;

- электрофоретическое разделение - метод препаративного и квекци­онного электрофореза.

Существуют также целый ряд комбинированных методов получения иммуноглобулиновых препаратов.

Наиболее простым в применении и недорогим является риваноло­вый метод получения гамма-глобулина

Риванол впервые был применен для фракционирования сывороточ­ных белков чехословацким исследователем Горжейши в 1952 г. Им было установлено, что при добавлении к сыворотке крови водно-риванолового раствора происходит осаждение альбуминов, бета- и альфа-глобулинов. Основная масса гамма-глобулинов остается в фильтрате.

Выделение гамма-глобулина этим методом проводится следующим образом. К одному объёму сыворотки крови постепенно добавляется три объёма раствора риванола в 0,4 %-ной концентрации, в результате чего в осадок выпадают альбумины и основная масса альфа- и бета-глобули­нов. Гамма-глобулин при таких условиях остается в растворе.

Кроме гамма-глобулина в растворе остается риванол, который уда­ляется активированным углем и фильтрацией через бумажные фильтры в воронках. При этом добавляется 10 г угля на 100 мл раствора. Смесь тщательно перемешивается. Полученный прозрачный раствор гамма-глобулина подвергают лиофильному высушиванию.

Технология получения гамма-глобулина риваноловым методом занимает мало времени, не требует дорогостоящего оборудова­ния, однако имеет некоторые недостатки:

1. Полученная фракция гамма-глобулина содержит примеси бета- и альфа-глобулинов.

2. Необходимо очищать фильтрат от риванола активированным уг­лем с последующей фильтрацией.

3. Необходимо высушивать большие объемы раствора гамма-гло­булина, т.к. сыворотка, на первом этапе получения гамма-глобулина, разводится раствором риванола в четыре раза.

4. Невозможно получить другие фракции белков сыворотки, т.к. под воздействием риванола выпавшие в осадок белки денатурируют.

Все вышеизложенное заставило исследователей проводить усо­вершенствование риванолового метода и предлагать для практики его различные модификации (рис. 20).

Рис. 20. Схема изготовления гамма-глобулина