3.3. Диагностические сыворотки для постановки реакции связывания комплемента, их приготовление и применение
При ряде инфекционных заболеваний образуются так называемые комплементсвязывающие (лизирующие) антитела, которые выявляют в реакции связывания комплемента (РСК).
Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
PCK проводят в две фазы:
- 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей комплекс «Антиген + антитело + комплемент»;
- 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним (антиэритроцитарные антитела).
Рис. 8. Реакция связывания комплемента с сывороткой крови
больного животного (положительная реакция)
В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная).
Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит – гемолизин, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).
Рис. 9. Реакция связывания комплемента с сывороткой крови
здорового животного (отрицательная реакция)
Чаще всего реакцию связывания комплемента применяют для диагностики бруцеллеза, сапа, кампилобактериоза, туляремии, лептоспироза, вирусных болезней (ящура, гриппа, ньюкаслской болезни и др.).
Для получения комплементсвязывающей сыворотки для диагностики туляремии используют кроликов, которых подкожно иммунизируют живой культурой F.tularensis вакцинного штамма 15 Н2ИЭГ. Антиген вводят 3-4 раза с интервалом 7-10 дней, затем тотально отбирают кровь и получают сыворотку.
Сыворотку проверяют в РСК на активность и специфичность.
Рис. 10. Четко положительный результат РСК (прозрачная надосадочная жидкость, четкий зонтик из эритроцитов)
|
Рис. 11. Четко отрицательный результат РСК (полный гемолиз эритроцитов (лаковая кровь), зонтик отсутствует)
|
Гемолитическую сыворотку (гемолизин) получают путем гипериммунизации кроликов эритроцитами баранов (валухов). Достижение титров антител гемолитической сыворотки 1:6000 и выше даёт основания к прекращению гипериммунизации кроликов. Через 7-10 суток после последней инъекции эритроцитов барана кроликов обескровливают, получают сыворотку и консервируют её фенолом.
При постановке РСК непременным условием является применение в качестве одного из её компонентов комплемента.
Комплемент - это неспецифический фактор гуморального иммунитета, содержащийся в сыворотках крови теплокровных и холоднокровных животных.
Комплемент представляет собой сложный комплекс белков (пептидогидролазы), транспортируемый (-глобулинами. 90% комплемента синтезируется клетками печени, 10% - моноцитами.
Наиболее изучен комплемент морской свинки. Поэтому при постановке РСК в качестве комплемента используют кровь морских свинок.