3. Приготовление диагностических сывороток

При промышленном производстве сыворотку получают методом цит­рирования крови с последующим сепарированием и дефибринирова­нием плазмы. Сыворотку крови консервируют 0,5 %-ным раствором фенола и от­стаивают в специальных емкостях в течение 2 месяцев. Отстоявшуюся сыворотку фильтруют через стерилизующие пластины.

Контроль сывороток проводят на стерильность, безвредность, специ­фичность и др.

Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них актив­ных белковых фракций, преимущественно гамма-глобулинов, и удалении балластных белков, не являющихся носителями антител (альбумины).

Выделенные фракции растворяют в меньшем объеме растворителя, по сравнению с исходным объемом, что позволяет сконцентрировать сыворотку (рис. 1).

Приготовление антигена

Карантинирование животных-продуцентов

Грундиммунизация животных

Отбор животных-продуцентов

Г ипериммунизация животных-продуцентов

Получение гипериммунной сыворотки

Цитрирование

Сепарирование

Дефибринирование

Очистка и концентрирование сыворотки

К онсервирование

Отстой сыворотки

Стерилизующая фильтрация

Контроль

Рис. 1. Схема приготовления гипериммунных сывороток

В промышленном производстве готовится множество диагностиче­ских сывороток. Технологические приемы приготовления их в общих чертах одинаковы. В то же время для приготовления отдельных сывороток имеются свои технологические особенности производства, которые для каждой сыворотки оговорены в соответствующей научно-технической документации.

3.1. Агглютинирующие сыворотки, их приготовление и применение

Явление агглютинации (склеивание антигенов антителами) впервые выявили Шарен и Роже в 1889 году. В 1896 году Грубер и Дургам уста­новили возможность использования реакции агглютинации (РА) для оп­ределения вида бактерий (рис. 2).

а) б)

Рис. 2. Агглютинация бактерий антителами класса JgM (а) и JgG (б)

Наиболее широко агглютинирующие сыворотки применяют при диф­ференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (эшери­хиозы, сальмонеллезы и др.), рода Brucella, Listeria и др.

Агглютинирующие сыворотки готовят путем гипериммунизации жи­вотных корпускулярными антигенами. В качестве антигенов используют живые или убитые культуры микроорганизмов. В связи с непостоянным содержанием антигенных компонентов у одного и того же вида бактерий желательно животных иммунизировать несколькими штаммами (2-3) этого вида микроба.

Для получения полноценных агглютинирующих сывороток в качестве антигенов используют культуры бактерий в S-форме, а в качестве имму­низируемых животных - кроликов.

Иммунизацию в большинстве случаев проводят внутривенным спо­собом в нарастающих дозах и интервалами в 4 суток. Обычно произво­дят 3-4 инъекции антигена.

Пробное взятие крови с целью установления титров агглютининов проводят через 6-7 суток после последнего введения антигена. Таким образом, весь цикл иммунизации длится около 1 месяца.

Примером получения диагностических сывороток может служить при­готовление агглютинирующих О-колисывороток.

В качестве продуцентов используют кроликов породы шиншилла ве­сом 3-4 кг в возрасте 6-12 месяцев.

Кроликов выдерживают в карантине не менее 3-4 недель.

Антигены - суспензия 18-20-часовых культур соответствующих се­ровариантов эшерихий, инактивированных кипячением 2 час.

Антиген в концентрации 2 млрд м.к. в 1 мл вводится кроликам в краевую ушную вену с интервалом в 3-5 суток в дозах 0,3; 0,6; 1,0; 2,0; 3,0 мл. Через 5-6 суток после последнего введения антигена у каждого кролика определяют титры антител.

От кроликов тотальным способом берут кровь и получают сыво­ротку.

Сыворотку фильтруют через стерилизующие фильтры, проверяют на стерильность, активность и специфичность, лиофильно-высушивают в ампулах.

Агглютинирующие сыворотки готовятся к леп­тос-пирам, листериям, бруцеллам, кампилобактериям, эшерихиям, саль­монеллам и другим микроорганизмам и используют в реакциях агглю­тинации (РА), торможения гемагглютинации (РТГА), непрямой гемагглю­тинации (РНГА), розбенгал пробе (РБП), кольцевой реакции с молоком (КР), крове-капельной реакции агглютинации (ККРА) и др. Технология их изготовления аналогична описанным, с учётом отдельных особенностей в каждом конкретном случае, что регламентируется соответствующими инструкциями.

РА используют для:

- определения возбудителя, выделенного от больного животного;

- определения антител в сыворотке крови больного животного.

На рис. 3 представлена ориентировочная реакция агглютинации на предметном стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного животного. Образуется хлопьевидный осадок.

а) б)

Рис. 3. Постановка реакции агглютинации на стекле

а) отрицательный результат, б) положительный результат (хлопья)

При определении возбудителя, выделенного от больного животного, ставят развернутую реакцию агглютинации. При этом, к разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного (рис. 4).

а) б) в)

Рис. 4. Постановка развернутой реакции агглютинации в пробирках

а) – агглютинация, б) – контроль сыворотки, в) – контроль антигена

Для определения антител в сыворотке крови больного животного разработано 2 варианта развернутой РА в пробирках. При этом, к разведениям сыворотки, полученной от больного животного добавляют антиген (диагностикум):

1. Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.

2. Агглютинация с Н - диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) происходит в виде крупно хлопчатой агглютинации протекает быстрее.