3.2. Преципитирующие сыворотки, их приготовление и применение
Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.
Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы, двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.
Преципитирующие сыворотки (гипериммунные сыворотки, содержащие антитела, осаждающие антигены) в РФ в больших объемах готовят для диагностики сибирской язвы (РП - реакция Асколи).
Первыми для этих целей получили преципитирующую сыворотку Асколи А. и Валенти У. в 1910 г. Они разработали метод обнаружения в исследуемом материале термостабильного антигена сибиреязвенной бациллы, представляющий собой реакцию преципитации с сибиреязвенной сывороткой.
В настоящее время в нашей стране преципитирующую сибиреязвенную сыворотку получают путём внутривенной иммунизации лошадей слобовирулентными штаммами возбудителя сибирской язвы 916-1, Ш-15, 94 и штаммом II вакцины Ценковского. Указанные штаммы выращивают на гороховом агаре с физиологическим раствором, тщательно встряхивают и фильтруют.
Лошадей гипериммунизируют поочерёдным введением каждого из указанных штаммов внутривенно. Всего делают 16-17 инъекций антигена, увеличивая дозу с 5 до 70 мл. В период гипериммунизации делают контрольные исследования на накопление антител. По окончании гипериммунизации кровь от лошадей берут через 9-16 суток после последнего введения антигена из расчёта 800 мл на 50 кг массы животного. Из крови получают сыворотку методом её цитрирования с последующим сепарированием и дефибринизацией плазмы. Сыворотку консервируют 0,5%-м раствором фенола, затем выдерживают в специальных отстойниках в течение 2 месяцев, после чего подвергают стерилизующей фильтрации, разливают во флаконы ёмкостью 50-100 см3, закрывают их резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. После этого препарат подвергается биологическому контролю.
Преципитирующие сибиреязвенные сыворотки применяют для проверки на сибирскую язву кожевенного сырья и патологического материала, подвергшегося загниванию (рис. 5).
Рис. 5. Реакция кольцепреципитации (реакция Асколи)
Реакцию кольцепреципитации проводят в узких преципитационных пробирках (пробирки Уленгута): на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации или реакция Асколи (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный антиген).
Кроме сибиреязвенных преципитирующих сывороток, готовят и применяют преципитирующие диагностические сыворотки, используемые для диагностики бруцеллёза, других бактериальных и ряда вирусных заболеваний (ящура, бешенства, лейкоза, инфекционной анемии). В этих случаях реакция преципитации ставится не в пробирках, а в агаровом геле в специально выштампованных в нём луночках (РДП - реакция диффузной преципитации или РИД – реакция иммунодиффузии).
Рис. 6. Реакция диффузной преципитации
Светлые полоски между лунками – линии преципитации, в которых
находится комплекс «Антиген-антитело»
Технологический принцип приготовления преципитирующих сывороток для РДП такой же, как и преципитирующих сибиреязвенных сывороток. Но в качестве доноров чаще всего используют кроликов.
Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена (рис. 7).
Рис. 7. Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини)
Реакцию радиальной иммунодиффузии используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.