2. Друга фаза загартовування рослин негативними температурами

Уперше здатність рослин гартуватися негативними температурами була встановлена І.І.Тумановим у озимої пшениці ще в 1931 р. Надалі були отримані дані про максимальну стійкість різних деревних порід у зимовий період. Так, у сосни хвоя ушкоджуватися за температури -55°. У берези, липи і ялини ушкодження з'явилися за такої ж температури. Дуб виявився менш загартованим: при -55° у нього спостерігалося багато відмерзлих частин. Яблуня Антонівка витримала -45° з невеликими ушкодженнями. Більш стійка яблуня Сибірська рожева: температуру -45° вона перенесла добре, а при -55° у неї вижили квіткові бруньки, але сильно постраждала деревина. Зазначена морозостійкість розвивалася у деревних порід, коли вони вже знаходилися в змушеному спокої. Особливо інтенсивне загартовування протікало при -10 і -15°. Сосна, береза, липа і навіть ялина за цих умов стають здатними переносити без істотних ушкоджень температуру -55°. Дуб і особливо культурні форми яблуні менш стійкі. Провесною, коли встановлюється погода із слабкими морозами, у дерев спостерігається різке зниження стійкості. Пізніше навесні, коли установилися температури трохи вище нуля з незначними заморозками, спостерігалося ще більш різке зниження стійкості однолітніх пагонів. Витривалі породи витримували в цей час тільки -15°.

2.1. Процеси замерзання і вимерзання рослинних клітин

Загальновизнаною причиною ушкодження рослин низькими температурами є утворення льоду до клітинах, що приводить до їх механічних ушкоджень. Спостереження за процесом замерзання хвої ялини (Туманов, Красенів, 1959) показали, що за повільного охолодження загартованих тканин лід спочатку утворюється поза клітинами. Вода виходить з них і замерзає в міжклітинниках. Протопласт за цього сильно збезводнюється. Клітини зщулюються, збільшуючи таким шляхом розміри міжклітинників. Однак за дуже сильних морозів (40, 65)° у мезофілі стиск клітин припиняється, причому вони стають непрозорими, у них з'являються темні штрихи (мал. 3). Очевидно, після часткового зневоднювання в цей час усередині протопласта з'являється лід. Такі клітини після відтавання не плазмолізуються. Мікроскопічні спостереження говорять про більш високу стійкість тонопласту у загартованих клітин порівняно з іншою частиною протопласта. Тонопласт у ялини узимку зберігається живим до -65°. Тонопласт потім за кімнатної температури відмирав звичайно через два дні. За швидкого охолодження клітини вимерзають іншим шляхом. За цих умов уже за температури -15° і нижче лід утворюється усередині клітин, клітини замерзають швидко одна за іншою, об’єм їх при цьому збільшується. Після відтавання клітини, усередині яких утворився лід, не плазмолізуються, тобто виявляються мертвими. За швидкого охолодження гине звичайно і тонопласт. Навіть загартовані клітини здатні переносити тільки відносно повільне охолодження. Якщо ж воно протікає швидко, вода не устигає відтікати з протопласта в міжклітинники, сильно переохолоджується, а потім і замерзає усередині протопласта, що завжди приводить до його загибелі. За дуже суворих морозів виживання клітин забезпечується тільки шляхом своєчасного зневоднювання їх у результаті утворення льоду в міжклітинниках. За умов позаклітинного льодоутворення загартований протопласт здатний витримувати не тільки сильне зневоднювання, але і механічні деформації. Відмирання може все-таки наставати після подальшого охолодження, наприклад, у ялини за температур нижче -40°, коли об’єм клітин перестає помітно зменшуватися. Такий же процес спостерігав Асахіна (1956). Це явище можна пояснити, якщо припустити можливість переохолодження води внаслідок утрудненого її відтоку з клітин за зниження температури до -40° або нижче. У клітинах накопичується переохолоджена вода, і слідом за тим утворюється лід усередині протопласта, руйнуючи його субмікроскопічну структуру. Пояснити вимерзання загартованих клітин зневоднюванням позаклітинним льодом не представляється можливим, тому що відмирання відбувається після того, як об’єм клітин за подальшого охолодження перестає помітно зменшуватися.

У менш морозостійких рослин (озимої пшениці) процес вимерзання клітин вивчали Г.Салчева і Г.А.Самигін (1963). Було встановлено, що за повільного охолодження загартованого листя до -3 і -4° з'являвся лід поза клітинами, а у незагартованих це відбувалося вже при -2,5-3°. За подальшого зниження температури кількість льоду збільшувалося. Унаслідок відтоку води паренхімні клітини стискалися. У загартованих рослин позаклітинний лід утворювався за температури до -9°, нижче -12° об’єм клітин помітно не зменшувався. За подальшого зниженні температури змінювалося забарвлення і зменшувалася прозорість клітин, але льоду в протопласті не було видно. Після відтавання ці клітини були мертвими. Зміна забарвлення клітин обумовлюється руйнуванням хлоропластів. У ушкоджених клітин протоплазма під час відтаванні розправлялася повністю і прилягала до клітинної стінки, але через кілька годин протопласт стискувався і відставав від клітинної стінки. Ушкоджені незагартовані протопласти також розправлялися, хоча і повільніше, повертаючись до первісної форми. Таке поводження клітин указує на те, що внутрішні шари протоплазми ушкоджуються раніш, ніж плазмалема, остання після відтавання ще кілька годин зберігає властивості напівпроникності. Застосовуючи прискорену кінозйомку, Самигін встановив, що замерзання клітини може відбуватися дуже швидко, завершуючись за 0,1 с. «Зародки» кристалів льоду поширювалися з замерзлої клітини в іншу, ще незамерзлу (мал. 4). Однак клітина може залишатися незамерзлою, будучи з усіх боків оточена замерзлими. Плазмолізовані клітини замерзають так само, як і тургесцентні, незневоднені, тобто спостерігалася передача запалу з боку замерзлої клітини, мабуть, за плазменними тяжами. Центри кристалізації в самих клітинах не виникали. Передбачається, що лід утворюється спочатку в протоплазмі, а потім дуже швидко у вакуолі. Потемніння клітин відбувається в результаті утворення дрібних кристалів льоду. Потім клітина світлішає. Унаслідок перекристалізації в ній утворюються більш великі прозорі кристали льоду.

Встановлено, що під час розвитку морозостійкості змінюється також структура плазмалеми, ендоплазматичного ретикулума та інших органел. У плазмалемі зимуючих паренхімних клітин спостерігалися вигини та інші деформації. Іноді в зовнішніх шарах протоплазми на місці плазмалеми міститься багато темних осміофільних краплин, що свідчить про нагромадження великої кількості ліпідів. Особливістю зимуючих клітин є збільшення тяжів і цистерн гладкого ендоплазматичного ретикулума. Мітохондрії узимку мали більш світлий матрикс і менш розвинуті крісти. У хлоропластах коровою паренхіми восени спостерігали великі крохмальні зерна, узимку під час морозної погоди ці зерна пропадали. Узимку хлоропласти мали сильно розвинуту строму і менше число гранів і ламел. Ці зміни електронномікроскопічної картини клітин під час розвитку морозостійкого стану свідчать про глибоку структурну перебудову, яка сприяє захистові від внутрішньоклітинного льодоутворення. Підвищення проникності плазмалеми сприяє своєчасному відтокові води з клітин у міжклітинники. Зміни структури протоплазми і вакуолі створюють умови, що утруднюють зародження і ріст кристаликів льоду усередині клітини.

На підставі мікроскопічних і електронномікроскопічних спостережень, проведених на різних рослинних об'єктах, які заморожували у різних температурних режимах, можна зробити наступні висновки щодо механізму вимерзання рослинних клітин. Швидке охолодження слабкостійких рослин приводить до замерзання води усередині клітин. У стійких об'єктів льодоутворення звичайне буває спочатку позаклітинним, однак надалі (за більш сильних морозів) частково збезводнені позаклітинним льодом клітини все-таки гинуть від утворення льоду усередині протопласта. У цьому випадку кристали внутрішньоклітинного льоду погано помітні у світловому мікроскопі, але на електронномікроскопічних препаратах, отриманих після заміщення льоду розчинником, у протопласті виявляється велике число порожнин. Навіть у сильно збезводненому протопласті після позаклітинного поступового замерзання до температури -10° при наступному швидкому охолодженні утворюється багато дрібних кристалів льоду, що виявляється по наявності відповідних дрібних порожнин. Тому можна припускати, що за сильних морозів переохолоджена вода в клітинах замерзає в результаті самочинного утворення в протопласті великого числа самостійних центрів кристалізації льоду. Утворення усередині протоплазми льоду, навіть його дрібних кристаликів, веде до швидкого зсуву структурних часток відносно один одного й у підсумку до руйнування структури.