Занятие 28

Тема занятия: Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Учебная цель занятия: Изучение принципов и методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Задачи занятия: Познакомиться с принципами и методами лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Разделы диагностики вирусных инфекций

Диагностика вирусных инфекций включает в себя следующие разделы: 1. Клинико-эпидемиологический диагноз: - анализ эпидемической обстановки; - клинические проявления заболевания. 2. Лабораторные методы диагностики.

К данным эпидемической обстановки относятся сведения о скорости распространения болезни, об охвате инфекцией населения, о случаях смерти, сезонности, наличии переносчиков инфекции, вакцинации людей против данной инфекции и др.

Клинические признаки болезни включают данные о температуре, пульсе, дыхании, состоянии кожных покровов и другие симптомы.

Тщательный анализ всех названных сведений позволяет поставить клинико-эпидемический диагноз, который носит только предварительный характер. Для того чтобы поставить окончательный диагноз на вирусное заболевание, необходимо располагать данными лабораторных исследований материала, взятого от больных.

Лабораторные методы диагностики вирусных инфекций включают следующие процедуры - вирусоскопическое исследование препаратов; - выделение и идентификация возбудителя; - обнаружение антигенов вирусов в образцах исследуемого материала; - обнаружение и определение титров противовирусных антител.

Вирусоскопическое исследование препаратов

Вирусоскопическое исследование препаратов при диагностике вирусных заболеваний проводится с помощью экспресс-методов, позволяющих обнаружить в патологическом материале вирусы в неактивной форме, то есть вирусные антигены, тельца-включения и элементарные тельца.

Для обнаружения вирусных антигенов в патологическом материале используют наиболее чувствительные методы, так как концентрация антигенов в нем обычно бывает низкой. Наиболее широко используют РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Для этого из патологического материала готовят мазки-отпечатки или срезы, которые обрабатывают гипериммунными сыворотками, предварительно мечеными флуорохромами. Препараты просматриваются с помощью люминесцентного микроскопа.

У гемагглютинирующих вирусов вирусные гемагглютинины в материале обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации. Явление гемагглютинации - склеивание эритроцитов крови в присутствии вируса.

Тельца-включения - это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках как результат репродукции в них некоторых вирусов. Как правило, РНК-вирусы образуют цитоплазматические включения, ДНК-вирусы - внутриядерные. Наиболее известны и имеют практическое значение тельца Бабеша-Негри, образуемые вирусом бешенства в цитоплазме нервных клеток. Обнаружение телец-включений при вирусных болезнях имеет лишь вспомогательное диагностическое значение. Крупные вирусы (элементарные тельца) в исследуемом материале обнаруживают под обычным световым микроскопом после их обработки солями тяжелых металлов (например, элементарные тельца при оспе).

Выделение и идентификация вирусов

Выделение и идентификация возбудителя - главное в диагностике вирусных инфекций. Для выделения вирусов используют следующие биологические системы: - культуры клеток; - куриные эмбрионы; - лабораторных животных.

1. Культуры клеток. Для заражения культуры клеток во флаконы с монослоем вносят небольшое количество вируссодержащей суспензии. После небольшого контакта добавляют поддерживающую питательную среду и помещаются в термостат. В лабораториях используют следующие виды клеточных культур: а) Первично-трипсинизированные культуры. б) Полуперевиваемые линии клеток. в) Перевиваемые линии клеток.

Признаками размножения вируса в культуре клеток является изменение морфологии клеток, их округление, гибель, фрагментация и другие изменения.

2. Куриные эмбрионы. Заражение куриных эмбрионов проводят следующими способами: - на хорион-аллантоисную мембрану; - в амниотическую полость; - в аллантоисную полость; - в желточный мешок.

Признаками размножения вируса в куриных эмбрионах являются их гибель и патологоанатомические изменения на оболочках и структурах эмбриона.

3. Животные модели. Наиболее часто используют белых мышей, белых крыс, хомячков, морских свинок, кроликов, птиц и обезьян; для выделения некоторых вирусов заражают мышат-сосунков. Существует большое количество методов введения инфекционного материала лабораторным животным. Выбор метода заражения зависит от тропизма вирусов и чувствительности животного. За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменение в их поведении, появление специфических признаков болезни. Признаками репродукции вирусов в организме животных являются их гибель, клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения в тканях.

Идентификация вирусов. После выделения вирусов их необходимо идентифицировать, то есть определить виды выделенных вирусов. Идентификацию вирусов осуществляют по количественным и качественным признакам, а также по морфологии вирусных частиц.

1. Качественное определение. Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т. д.), куриных эмбрионах и культурах клеток. Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции клеток, либо их разрушение. Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по следующим критериям: - цитопатические эффекты; - бляшкообразование; - тельца включений; - феномен гемадсорбции; - “цветная реакция”.

Цитопатические эффекты (ЦПД - цитопатическое действие, ЦПЭ -цитопатический эффект) оценивают при микроскопии клеточных культур. ЦПД - это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в ней вируса. Оно устанавливается под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД разнообразны - от едва заметных изменений в цитоплазме до полного распада клеток на фрагменты. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование. Бляшками называют негативные колонии - участки разрушенных клеток (зоны просветления) на монослое клеток, покрытом слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).

Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований - скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Феномен гемадсорбции. Методом гемадсорбции обнаруживают вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами. Гемадсорбция - это прилипание эритроцитов к поверхности клеток, зараженных гемагглютинирующим вирусом. Для наблюдения гемадсорбции необходимо из пробирки или флакона с зараженной вирусом культурой клеток удалить культуральную жидкость и в них добавить 2-3 капли 2,5%-ной суспензии эритроцитов. Пробирки, флаконы оставляют в горизонтальном положении в течение 10 минут, затем слой клеток споласкивают физраствором, чтобы смыть эритроциты. Если в зараженной культуре клеток происходит репродукция вируса, на таких клетках под микроскопом можно видеть адсорбированные эритроциты.

“Цветная реакция”. В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вносят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет первоначальный (красно-оранжевый) цвет. Если клетки остаются жизнеспособными, питательная среда желтеет.

2. Количественное определение вирусов проводят путем определения инфекционной активности вируссодержащего материала. Для этого готовят серийные десятикратные разведения исследуемого материала, а затем каждым разведением заражают по нескольку пробирок с клеточной культурой или несколько лабораторных животных.

Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения - подсчет числа вирусных бляшек. Прямые тесты на инфекционность применяют для установления инфекционной дозы (ИД) или летальной дозы (ЛД) изучаемого вируса (обычно выражают в lg). ИД50 - разведение, инфицирующее 50% клеток; ЛД50 - разведение, убивающее 50% пораженных клеток или животных.

Количественную электронную микроскопию применяют для подсчета общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом объекте (например, культуральной жидкости). Однако чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора.

Обнаружение антигенов вируса в исследуемом материале

Для выявления вирусных антигенов наиболее распространенным методом является реакция гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбироваться на поверхности эритроцитов животных и человека.

Если вирус выделен на культуре клеток, и он дает гемадсорбцию, то используют реакцию торможения гемадсорбции - РТГАд.

Если вирус обладает гемагглютинирующей активностью, наиболее целесообразно для идентификации использовать реакцию торможения гемагглютинации - РТГА.

Если же выделенный вирус указанными свойствами не обладает, то его идентификацию проводят с помощью реакции диффузной преципитации в агаровом геле - РДП. Но для постановки этой реакции вирусный антиген и гипериммунная сыворотка должны быть в высоких титрах, так как РДП обладает сравнительно низкой чувствительностью.

Если РТГАд, РТГА и РДП воспользоваться не представляется возможным, то для идентификации выделенного вируса используют реакцию связывания комплемента (РСК) с разными разведениями известных сывороток и несколькими дозами комплемента. Предпочтительнее ставить эту реакцию длительно на холоде (18-20 часов при +2…-4°С).

Наиболее универсальной и дающей более достоверные результаты при идентификации выделенных вирусов является реакция нейтрализации - РН. Вместе с тем постановка РН требует длительной работы и вложения большого труда.

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления антигенов некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 минут. Для выявления антигенов на твердой фазе сорбируют известные антитела и добавляют исследуемую сыворотку, содержащую антиген. После инкубирования несвязанный антиген декантируют, систему промывают и вносят меченые антитела, специфичные к сорбированным антителам. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключенные в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Выявление противовирусных антител в сыворотке крови

Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 недели. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырехкратное увеличение титра антител, выявленное при исследовании второй пробы.

РТГА выявляет антитела, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела в сыворотке больного.

РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций. Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов антител, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с антителами, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определенные выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления антител известный антиген сорбируют на твердом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся антитела удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных антител и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических антител, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом.

Серологические методы диагностики вирусных болезней

В вирусологии широко используют следующие серологические реакции: - нейтрализации – РН; - торможения гемагглютинации – РТГА; - непрямой гемагглютинации – РНГА; - связывания комплемента – РСК; - диффузной преципитации – РДП; - торможения гемадсорбции – РТГАд; - иммунофлуоресценции - РИФ.

1. Реакция нейтрализации (РН) основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными антителами. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных антител. Реакция нейтрализации ставится в двух модификациях: а) с разными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного вируса для обнаружения и титрования неизвестных противовирусных антител; б) с постоянным разведением известной гипериммунной сыворотки и разными дозами вируса для идентификации неизвестного выделенного вируса по индексу нейтрализации.

2. Реакция торможения гемагглютинации - РТГА. Ее принцип состоит в том, что при контакте вируса с гомологичными антителами происходит связывание антител с гемагглютининами вируса, в результате чего вирус теряет свойство агглютинировать (склеивать) эритроциты. Для этого исследуемую сыворотку в разных разведениях смешивают с одинаковыми дозами известного вируса и после контакта ко всем смесям добавляют суспензию эритроцитов, которые служат индикатором вирусных гемагглютининов. При высшем разведении исследуемой сыворотки, когда еще подавляется гемагглютинация, и определится титр антител в этой сыворотке.

3. Реакция непрямой гемагглютинации - РНГА. Ее принцип состоит в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы вирусы, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови. РНГА позволяет обнаруживать и титровать антитела. За титр антител в сыворотке крови принимают наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию сенсибилизированных вирусом эритроцитов. РНГА можно поставить макро- и микрометодами.

4. Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при ее отсутствии делают заключение о несоответствии вируса используемой антисыворотке.

5. Реакция связывания комплемента (РСК). На первом этапе в реакции участвуют антиген и антитело, а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии вирусного антигена и специфического к нему антитела образуется комплекс, и он связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы, состоящей из бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки кролика. Если комплемент связался при взаимодействии вирусного антигена и специфических к нему антител, то лизис (растворение) бараньих эритроцитов не происходит, что свидетельствует о положительной РСК. При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов, по которому судят о результатах реакций.

6. Реакция диффузной преципитации (РДП) основана на способности специфических антител сыворотки крови и специфических растворимых вирусных антигенов диффундировать в толще агарового геля навстречу друг другу, в результате чего образуется комплекс “антиген+антитело”. Этот комплекс не обладает способностью диффундировать в агар и выпадает в осадок на месте образования в виде полосы преципитации, видимой невооруженным глазом. Если же антитела и антиген не соответствуют (негомологичны) друг другу, то полосы преципитации не образуются, что свидетельствует об отрицательной РДП.

7. Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой, содержащей антитела к этому вирусу. Она позволяет идентифицировать гемагглютинирующий вирус в культуре клеток намного раньше появления отчетливых цитопатических изменений в пораженных вирусом клетках.

8. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Ее сущность состоит в обработке препаратов-отпечатков из патологического материала сывороткой крови, содержащей специфические антитела к определенному вирусу и обработанной флуорохромом (веществом, способным светиться при облучении светом). Если вирусный антиген и меченая сыворотка, содержащая специфические к данному вирусу антитела, соответствуют друг другу, то происходит образование комплекса "антиген+антитело", и он обнаруживается с помощью люминесцентного микроскопа по специфическому свечению. Наибольшее распространение получила реакция прямой иммунофлюоресценции.

9. Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами антитела, но сложность и дороговизна метода ограничивает его применение.

10. К методам, основанным на принципе использования меченых антител, относится иммуноферментный анализ (в иностранной литературе ELISA). Принцип метода состоит в обнаружении антигена, фиксированного на очередном носителе, специфическими глобулинами, мечеными ферментами (пероксидаза хрена, кислая или щелочная фосфатаза). Фермент проявляют различными субстратами, дающими с ним характерное окрашивание, которое определяют фотометрическим методом.

11. Радиоиммунный метод основан на использовании меченого радиоактивным йодом антигена. Антиген, соединяясь с антителом, образует меченый иммунный комплекс антиген-антитело. Результат определяют на счетчике.

12. Метод иммуноэлектрофореза основан на способности антигенов и антител диффундировать в геле под действием электрического поля.

13. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счет интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на нее), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в нее вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым антителам.

Контрольные вопросы по теме занятия: 1. Разделы диагностики вирусных инфекций. 2. Вирусоскопическое исследование препаратов. 3. Методы выделения вирусов. 4. Методы идентификации вирусов. 5. Обнаружение вирусных антигенов в исследуемом материале. 6. Выявление противовирусных антител в сыворотке крови. 7. Серологические методы, используемые в диагностике вирусных инфекций.

Литература для подготовки к занятию: Основная литература: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004. Дополнительная литература: 1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002. 2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005. 3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.