Занятие 15

Тема занятия: Лабораторные методы оценки функционального состояния Т- и В-систем иммунитета.

Учебная цель занятия: Ознакомиться с основными методами лабораторных исследований Т- и В-систем иммунитета, значениями некоторых иммунологических показателей, характеризующих состояние Т- и В-звеньев иммунитета.

Задачи занятия: Ознакомиться с методикой постановки реакций розеткообразования для подсчета Т- и В-лимфоцитов, реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Определить значение отдельных показателей иммунограммы для оценки состояния иммунитета.

Методика постановки иммунологических реакций:

• Кровь для исследования в количестве 1 – 2 мл берут из локтевой вены в пробирку с раствором гепарина. Для отделения лейкоцитов от эритроцитов  пробу крови осторожно наслаивают на раствор, содержащий смесь фиколл-верографин или фиколл-гипак (плотность раствора 1,077 г\мл) и  центрифугируют при 1,5 тыс об\мин в течение 40 – 45 мин. Эритроциты оседают на дно пробирки, а лейкоциты, обладающие меньшей плотностью,   остаются в верхней части пробирки в виде мутного кольца. Фракцию    лейкоцитов осторожно отсасывают пипеткой и двукратно отмывают путем    центрифугирования средой 199.

• Реакция розеткообразования используется для количественного определения  содержания Т- и В-лимфоцитов.  Вследствие качественных различий рецепторов на клеточных мембранах Т- и  В-лимфоциты различаются по способности адсорбировать эритроциты животных. Т-лимфоциты способны адсорбировать эритроциты барана и  называются Е-розеткообразующие клетки (Е-РОК). В-лимфоциты   адсорбируют эритроциты мыши и называются М-РОК. Для постановки реакции розеткообразования взвесь лейкоцитов смешивают  с предварительно отмытыми эритроцитами животного (соотношение эритроциты: лимфоциты должно соответствовать 20 : 1 – 50 : 1). Смесь   выдерживают 10 мин при 37 °С, затем центрифугируют и оставляют на 18   часов при 4 ° С. На предметном стекле готовят тонкий мазок из клеточной    суспензии, окрашивают по Романовскому – Гимзе, микроскопируют с   объективом x 40. При подсчете 300 лимфоцитов определяют процент клеток,   адсорбировавших на себе 3 и более эритроцитов. В норме у взрослых людей   содержится 60 – 67% Е-РОК и 6 – 12% М-РОК . 20 – 25% лимфоцитов не  способны образовывать розетки. Они называются нулевыми клетками (0-клетки). Это популяция Т-лимфоцитов, включающая натуральные Т-киллеры,  а также незрелые Т- и В-лимфоциты.

• Определение содержания CD4 и CD8 клеток. Популяция Е-РОК состоит   преимущественно из CD4 и CD8 лимфоцитов. Для их количественного определения ставят    реакцию розеткообразования с эритроцитами барана в присутствии теофиллина. Теофиллин повышает уровень внутриклеточного цАМФ и    ингибирует реакцию розеткообразования CD8.    Таким образом, при параллельной постановке реакции розеткообразования   с теофиллином и без него можно определить количество хелперов    (теофиллинрезистентные клетки) и суммарное количество CD4 и CD8 клеток.

Количество CD8 (теофиллинчувствительные клетки) определяется по  формуле: Тфч = Е-РОК – Тфр. В норме у здорового человека количество Т-хелперов составляет 50 – 60%, Т-цитотоксических лимфоцитов – 12 – 20%   от общего числа    лимфоцитов. Соотношение CD4 : CD8 (в процентах) составляет  1,3 – 7,5.    Уменьшение этого показателя до 1,0 или менее свидетельствует о  наличии  иммунодефицита.

• Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Бласттрансформацией называется  феномен превращения лимфоцитов в крупные делящиеся клетки под   действием специфических и неспецифических митогенов. Некоторые  полисахариды растительного происхождения (фитогемагглютинины)   способны при добавлении к суспензии лимфоцитов вызывать неспецифическую бласттрансформацию Т-лимфоцитов.  Способность образовывать бласты в ответ на стимуляцию ФГА отражает  степень готовности иммунной системы к иммунному ответу. Количество  образующихся бластных клеток оценивают через 24 часа инкубации  лимфоцитов с митогеном путем микроскопии либо радиоизотопным методом.  В норме у взрослого человека после стимуляции ФГА не менее 70% лимфоцитов должно превращаться в бласты. Снижение этого показателя   свидетельствует об угнетении иммунной системы. При постановке РБТЛ с определенными антигенами (микробными,  вирусными) можно определить клеточную реакцию на конкретный антиген. При этом образовывать бласты будут клетки, несущие рецепторы к данному  антигену.

Основные правила интерпретации иммунограмм:

1. Комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности.

2. Анализ иммунограммы в динамике всегда более информативен как в диагностическом, так и в прогностическом отношении, нежели однократно полученная иммунограмма.

3. Реальную информацию несут лишь сильные сдвиги показателей.

4. Полноценный анализ иммунограммы можно проводить лишь в комплексе с оценкой клинической картины заболевания у данного пациента.

5. Отсутствие существенных сдвигов показателей иммунограммы при наличии выраженной картины воспалительного процесса свидетельствует об атипичной реакции иммунной системы и является отягощающим признаком течения процесса.

6. В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы позволяет делать ориентировочные, а не безусловные выводы.

Приложение 1 Средние значения показателей иммунограммы у взрослых здоровых людей 

Приложение 2

Иммунограмма на отдельных стадиях воспалительного процесса

Стадия продромы: Уменьшение относительного количества эозинофилов, базофилов, Т-лимфоцитов. Повышение процента О-клеток.

Стадия развития клинической картины заболевания: Повышается лейкоцитоз, увеличивается относительное число нейтрофилов, снижается количество лимфоцитов и эозинофилов. Появляется сдвиг ядерной формулы нейтрофилов влево. Дальнейшее снижение числа эозинофилов. Дальнейшее снижение содержания Т-лимфоцитов и повышение уровня О-клеток.

Стадия развернутой клинической картины заболевания: Лейкоцитоз достигает максимальных значений, сдвиг ядерной формулы влево остается, повышается СОЭ (повышение быстрое и длительное – до 2 месяцев после окончания процесса). Показателем интоксикации является снижение фагоцитарной активности нейтрофилов (Фз) при неизменной или усиленной адгезивной способности этих клеток (Фа). Крайним неблагоприятным прогностическим признаком на этом этапе заболевания является дальнейшее понижение количества Т-лимфоцитов и повышение содержания О-клеток. Повышение количества CD8 по сравнению с CD4 на фоне сниженной фагоцитарной активности указывает на тяжесть процесса на фоне сильной интоксикации. Неблагоприятное прогностическое значение всех признаков усугубляется на фоне снижения уровня лейкоцитов.

Период кризиса и завершения клинической картины заболевания: Предшественником кризиса является нормализация содержания эозинофилов. Отмечается рост относительного количества В-лимфоцитов, хотя и не во всех случаях. Увеличивается количество CD8 – на этапе выздоровления это благоприятный прогностический признак. Восстанавливается количество Т-лимфоцитов, снижается уровень О-клеток. Снижается количество лейкоцитов, нормализуется сдвиг ядерной формулы.

Стадия реконвалесценции и полное выздоровление: Самым надежным постоянным критерием незавершенности воспалительного процесса является снижение количества Т-лимфоцитов и повышение уровня О-клеток. СОЭ остается на высоком уровне долго.

Классификация лейкограмм

1. Нейтрофильно-лимфоцитарный тип – классический тип, встречающийся при гнойно-септических заболеваниях (микробная пневмония, рожа и т.д.). Характеризуется наличием хорошо выраженных нейтрофильной и лимфоцитарной фаз. 2. Нейтрофильный тип – имеется максимально расширенная по времени нейтрофильная фаза, которая переходит в слабо выраженную лимфоцитарную лишь на этапе выздоровления. Наиболее характерен для заболеваний, в которых ведущим компонентом является токсин микроорганизмов (например, дифтерия ). 3. Лимфоцитарный тип – нейтрофильная фаза сокращена до минимума, слабо выражена. Основное время заболевания занимает лимфоцитарная фаза. Этот тип иммунограммы характерен для вирусных инфекций, угнетающих нейтрофильный росток (корь, грипп).

Сдвиги показателей, которые уточняют характер лейкограмм того или иного типа:

1. Эозинофилия. Сопутствует усилению синтеза IgE, характеризует наличие в процессе аллергического компонента.

2. Моноцитоз. Характерен для воспалительных процессов с ярко выраженным компонентом гиперчувствительности замедленного типа.

3. Соотношение CD/ CD8 больше максимального значения нормы (больше 5). Возникает при резком снижении CD8, характерно для ряда аутоиммунных заболеваний (саркоидоз).

4. Резкое увеличение СОЭ наблюдается при ряде заболеваний, например, при узелковом преиартерите СОЭ достигает 70 мм/ч.

5. Слабая реакция лейкограммы на воспалительный процесс. Подобные сдвиги наблюдаются при стертом течении болезни (воспалительных заболеваний), локальных воспалительных процессах (вагините, вульвите, конъюнктивите, ячмене, цистите, тромбофлебите), воспалительных процессах, вызванных агрессивным началом с низкой иммуногенностью и высокой инвазивностью (многие злокачественные опухоли).

Литература для подготовки к занятию: Основная литература: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред.А.А. Воробьева. М., 2004, 265-269. Дополнительная литература: 1. Л.Б.Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002, 322-325.