Занятие 26

Тема занятия: Патогенные клостридии и клостридиозы. Возбудители столбняка, анаэробной раневой инфекции, ботулизма. Патогенез и клиника клостридиозов. Лабораторная диагностика. Специфическая терапия и профилактика.

Учебная цель занятия: Изучение биологических свойств возбудителей столбняка, анаэробной раневой инфекции, ботулизма, патогенеза и клиники вызываемых заболеваний, методов лабораторной диагностики, принципов терапии и специфической профилактики указанных инфекций.

Задачи занятия: Познакомиться с основными свойствами возбудителей столбняка, анаэробной раневой инфекции, ботулизма методами лабораторной диагностики вызываемых заболеваний, средствами специфической профилактики и лечения указанных инфекций.

Спорообразующие бактерии рода Clostridium

Род Сlostridium семейства Bacillaceae отдела Firmicutes образуют подвижные (перитрихи) и реже неподвижные палочки. Отличительная особенность клостридий - способность образовывать овальные или круглые эндоспоры, которые могут располагаться центрально, субтерминально или терминально. Наиболее характерные признаки клостридий - способность вызывать масляно-кислое брожение и анаэробный распад углеводов с образованием масляной кислоты и газов (СО₂, водород, иногда метан). Большинство видов - строгие анаэробы. Клостридии обитают в почве, на дне пресных и солёных водоёмов, в кишечнике человека и животных. Некоторые виды патогенны для человека и животных, а некоторые используются в производстве органических кислот и спиртов.

Возбудители газовой гангрены

Газовая гангрена (греч. gangraina - разъедающая язва) - раневая инфекция, характеризующаяся крепитацией окружающих тканей из-за пузырьков газа (продукта ферментативного действия клостридий), некрозом тканей в результате уменьшения или полного отсутствия кровоснабжения и общими септическими проявлениями. Наиболее часто её вызывают С. perfringens, С. novyi и С. septicum; реже - С. histoliticum, С. bifermentans, С. ramosum, С. sporogenes, С. fallax, С. sordelli и др.

С. perfringens Один из наиболее распространённых патогенных видов. По способности образовывать четыре главных токсина (α-, β-, ε- и -)микроорганизмы разделяют на шесть сероваров - А, В, С, D, Е и F. Основной возбудитель заболеваний человека - бактерии типа А. С. perfringens типа А открыли американские патологи У. Уэлч и Г. Наттелл (1892). Чистую культуру получили французские бактериологи А. Вейон и Ж. Жубер (1893), давшие ему название perfringens (лат. perfringo – проламываться).

Эпидемиология. С. perfringens распространены повсеместно; бактерии выделяют из воды, почвы и сточных вод. Также они колонизируют кишечник животных и человека (выделяют у 25-35% здоровых лиц). У человека С. perfringens вызывает два типа поражений - газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.

Морфология и тинкториальные свойства. Вегетативные клетки представлены короткими крупными палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0x1-1,5 мкм). Отличительные особенности бактерий - положительная окраска по Граму и отсутствие подвижности. In vivo образуют капсулы. Споры крупные, овальные, расположены центрально. Термоустойчивость спор сероваров В и D относительно невысока (погибают при кипячении в течение 15-30 минут), споры типов А и С выживают при кипячении и даже автоклавировании в течение 1-6 часов. Спорообразование обычно происходит в почве и кишечнике организма хозяина.

Культуральные свойства. На плотных средах бактерии образуют S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями, серовато-белого цвета. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями. На кровяном агаре колонии окружены зоной гемолиза. На желточном агаре бактерии образуют колонии, окружённые зоной перламутрового преципитата, образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.

Рост в жидких и полужидких средах. Первые признаки роста на среде Китта-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 часа и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании.

Антигенная структура. Выделяют 6 сероваров (А-F) С. perfringens, различающихся по антигенным свойствам продуцируемых экзотоксинов.

Биохимические свойства. Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты и газа, восстанавливают нитраты, расщепляют лактозу, образуют лецитиназу. Протеолитическая активность слабая: разжижает желатину, не разлагает казеин. Интенсивно створаживают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка, напоминающего пену на волнах. Это феномен известен как “штормовая реакция”.

Токсины. С. perfringens образуют как минимум 12 идентифицированных токсинов (ферментов) и энтеротоксин.

Газовая гангрена развивается при попадании С. perfringens в рану, где бактерии активно размножаются в условиях пониженного содержания кислорода. Микроорганизмы, а чаще их споры могут быть занесены в рану из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ пациента. Для поражений характерны некроз тканей и образование газа с гнилостным запахом.

C. novyi Бактерии впервые выделили М.В. Вейнберг и Э. Сэген (1891). Более полно возбудителя охарактеризовал американский бактериолог Ф. Нови (позднее возбудитель был назван по его имени). Микроорганизм широко распространён в природе, может быть выделен из почвы, а также из органов ЖКТ здоровых животных.

Морфология и культуральные свойства. Вегетативные клетки крупные или слегка изогнутые подвижные грамположительные палочки размером 4-10x1-2 мкм; перитрихи (20-25 жгутиков). Облигатный анаэроб. Споры овальные, расположены субтерминально. Устойчивы к нагреванию (выживают при кипячении в течение 1-2 часов). На плотных средах через 48 часов образуют круглые сочные сероватые полупрозрачные колонии, иногда с зернистой поверхностью и неровными краями. На КА возбудитель образует шероховатые колонии. В жидких средах колонии растут медленно.

Биохимические свойства. Бактерии типов А, В и С ферментируют глюкозу, фруктозу и мальтозу, а тип D - только глюкозу; глицерин разлагают все микроорганизмы. Протеолитические свойства у C. novyi выражены слабо; все штаммы разлагают желатин, свёртывают молоко (медленно), но не разлагают свернувшийся яичный белок.

Патогенность. C. novyi типов А и В вызывают газовую гангрену у человека и животных (наиболее частый возбудитель - тип А). Бактерии вырабатывают 8 токсинов, определяющих их патогенность.

С. histolyticum Подвижная палочка размером 3-5x0,5-0,8 мкм. В мазках часто образует пары или цепочки. Образует субтерминальные споры. Строгий анаэроб. На КА он образует прозрачные выпуклые колонии диаметром 0,5-1 мм, окружённые тонкой зоной гемолиза. В толще агара неподвижные штаммы образуют “пушинки” с уплотнённым центром. Бактерии вызывают сплошное помутнение жидких сред с протеолизом кусочков мяса и печени на дне. Бактерии инертны к углеводам; не образуют индол, но вырабатывают большое количество сероводорода. Проявляют выраженные протеолитические свойства - разлагают желатин, свернувшуюся сыворотку, яичный белок и коллаген (греч. histolyticum - растворяющий ткани). Продуцируют 5 токсинов.

C. septicum C. septicum (палочка Гона-Сакса) - полиморфные подвижные палочки размером 4-5x0,8 мкм. В тканях способны образовывать нити длиной до 500 мкм; в культурах образуют цепочки. Строгие анаэробы. На поверхности плотных сред образуют блестящие полупрозрачные колонии (диаметром до 4 мм) с неровными краями (имеют тенденцию к ползучему росту). На агаре Цейсслера через 48 часов палочки образуют сплошной нежный налёт, окружённый зоной гемолиза. В столбике 1% агара формируют колонии с отходящими переплетающимися нитями, на 2% агаре колонии имеют вид дисков. Ферментируют некоторые углеводы. Продуцируют 4 экзотоксина.

С. sporogenes С. sporogenes - подвижные палочки размером 3-6x0,5 мкм. Проявляют протеолитическую активность и инертны в отношении большинства углеводов. Палочка не образует токсинов.

С. sordelli С. sordelli - подвижная палочка размером 2-4x0,6-1 мкм. Факультативный анаэроб. На плотных средах через 24-48 часов образует выпуклые сероватые колонии с неровными краями. На желточном агаре с лактозой колонии окружают зоны опалесценции. В жидких мясных средах даёт интенсивный рост, часто с образованием слизи. Ферментирует многие углеводы; проявляет выраженные протеолитические свойства. Вирулентные штаммы продуцируют токсины.

С. fallax С. fallax - подвижная прямая палочка с закруглёнными концами, размером 2-5x0,5 мкм. Строгий анаэроб. На плотных средах через 24-48 часов образует мелкие плоские прозрачные колонии с неровными краями; на КА даёт узкую полоску гемолиза. Ферментирует углеводы; проявляет умеренную протеолитическую активность, свёртывают молоко с образованием кислоты. Не образует сероводорода, индола и не восстанавливает нитраты.

Принципы микробиологической диагностики Материалом для исследований служат биоптаты поражённых тканей, отёчная жидкость, перевязочный и шовный материал, одежда, образцы почвы.

Микроскопия материала позволяет обнаружить крупные грамположительные палочки.

Выделение и идентификация возбудителей. Для выделения используют жидкие и плотные среды. Идентификацию микроорганизма осуществляют набором стандартных тестов (подвижность, серологические реакции и др.).

Жидкие среды (обычно Китта-Тароцци) используют для накопления возбудителей. С жидких сред проводят пересев на плотные среды. При подозрении на смешанную флору исследуемый материал разделяют на две части. Одну засевают на жидкие среды без прогревания, а вторую прогревают после посева, что позволяет выделить клостридии из термоустойчивых спор.

Плотные среды. Наибольшее распространение нашли агар Цейсслера, КА с бензидином и среда Вильсона-Блэра. На КА с бензидином колонии C. novyi быстро чернеют на воздухе. На среде Уилсона-Блэра С. perfringens через 4-5 часов вызывает почернение столбика среды за счёт образования сульфида железа из Na₂S и FeCl₃, а также её разрывы вследствие образования СO₂ из глюкозы.

При отсутствии анаэростата можно воспользоваться посевом по Перетцу. Для этого в расплавленный и охлаждённый сахарный агар вносят культуру бактерий и заливают под стекло, помещённое на пробковых палочках в чашку Петри.

Токсинообразование. Для обнаружения токсинов проводят заражение белых мышей вытяжкой из исследуемого материала, фильтратами бульонных культур или кровью больных. Идентификацию токсинов проводят в РН со специфическими антитоксическими антисыворотками.

Возбудитель столбняка

Столбняк - тяжёлое заболевание, опосредованное нейротоксическим действием бактериального экзотоксина. Возбудитель заболевания С. tetani. Практически одновременно возбудитель открыли Н.Д. Монастырский (1883) и А. Николайер (1884). В чистой культуре бактерии впервые выделил Ш. Китазато (1889).

Эпидемиология. Естественный резервуар и источник инфекции - почва. Заражение человека - следствие бытовых и производственных травм. Заболеваемость значительно возрастает во время военных действий. Основная группа риска в мирное время - работники сельского хозяйства (составляют 80-86% заболевших).

Морфология и тинкториальные свойства. Вегетативные клетки. Грамположительные палочки с закруглёнными концами длиной 4-8 мкм и толщиной 0,3-0,8 мкм. Подвижны (содержат 20 жгутиков и более, расположенных по периферии клетки). В мазках располагаются одиночно или цепочками.

Споры. Круглые, реже овальные, расположены терминально. Их диаметр в 2-3 раза превышает толщину бактерий, вследствие чего они напоминают “теннисные ракетки” или “барабанные палочки”. Споры устойчивы к химическим и физическим воздействиям; они выживают в течение 8-10 часов в 1% растворе сулемы и 5% растворе фенола, а также выдерживают кипячение в течение 0,5-1 часа.

Культуральные свойства. С. tetani - строгий анаэроб. На МПА и желатине возбудитель растёт медленно и образует тонкие прозрачные колонии двух типов: гладкие, прозрачные S-колонии и серовато-жёлтые, шероховатые R-колонии.

Антигенная структура. У С. tetani выявляют О- и Н-антигены. По жгутиковым антигенам (Н-антигенам) выделяют 10 сероваров.

Биохимические свойства. Большинство штаммов инертно к углеводам. С. tetani проявляет слабые протеолитические свойства и медленно расщепляет белки и пептоны до аминокислот.

Патогенез поражений. Основные факторы патогенности - тетаноспазмин и тетанолизин. Действие этих токсинов на организм, в особенности тетаноспазмина, обусловливает развитие столбняка у человека и животных.

Тетаноспазмин - полипептид. Токсин фиксируется на поверхности отростков нервных клеток, проникает в них путем эндоцитоза и посредством ретроградного аксонного транспорта попадает в ЦНС. Механизм действия связан с подавлением высвобождения тормозных нейромедиаторов в синапсах (токсин связывается с синаптическими белками синаптобревином и целлюбревином).

Тетанолизин (тетаногемолизин) проявляет гемолитическое, кардиотоксическое и летальное действие.

Клинические проявления. Ведущие проявления - судорожный синдром, включающий болезненные сокращения мышц (тетанус) и длительное напряжение мышц. К характерным признакам столбняка относят опистотонус - тетанический спазм, когда позвоночник и конечности максимально разогнуты, больной лежит на спине и опирается на затылок и пятки, и risussardonicus (risuscaninus) – подобие оскала, вызванного спазмом лицевых мышц.

Лёгкая форма (локальный столбняк) характеризуется периодическими спазмами в поражённой области.

Генерализованная форма (генерализованный столбняк) - наиболее частая форма с характерными мышечными спазмами. Характерны тонические спазмы лица и глотки, слабость, тахикардия, аритмии, менингит, гипокальциемия. После выздоровления невосприимчивость к последующим заражениям не вырабатывается.

Принципы микробиологической диагностики. При развитии типичной клинической картины выделение возбудителя и его идентификация могут не потребоваться. Бактерии обычно обнаруживают в месте проникновения в организм больного. Поэтому наиболее рационально исследование различного материала, взятого в месте ранения. В тех случаях, когда входные ворота неизвестны, следует тщательно осмотреть больного для выявления ссадин, царапин, катаральных и воспалительных процессов. Особо следует обратить внимание на старые рубцы после ранений, так как возбудитель может долго в них сохраняться.

Выделение возбудителя. Исследованию подлежит перевязочный и шовный хирургический материал. Посев производят на среду Кита-Тароцци.

Иммунопрофилактика. Проводят плановые и экстренные мероприятия.

Плановая иммунизация. Вакцинацию начинают с 3-месячного возраста столбнячным анатоксином, чаще всего в составе АКДС-вакцины (содержит столбнячный и дифтерийный анатоксины и убитые бактерии коклюша). Иммунизацию проводят по стандартной схеме с последующей ревакцинацией через 5-10 лет.

Экстренная иммунизация. Проводят при травмах, ранениях. В зависимости от давности предшествующей вакцинации проводится либо пассивная иммунизация (однократное введение 3000 МЕ противостолбнячной лошадинойсыворотки), либо активно-пассивная иммунизация: сначала вводят столбнячный анатоксин, а через 30 минут - 950 МЕ противостолбнячного иммуноглобулина человека.

Лечение. Для специфической терапии используют внутривенное введение больших доз противостолбнячного иммуноглобулина человека.

Возбудитель ботулизма

Ботулизм (лат. botulus – колбаса) – тяжелое пищевое отравление, вызываемое экзотоксином бактерии Сlostridium botulinum . Возбудитель ботулизма открыл бельгийский бактериолог Э. ван Эрменген (1869).

Морфология и тинкториальные свойства. С. botulinum - подвижная грамположительная палочка средних размеров с закруглёнными концами. В мазках располагается одиночно, иногда в виде коротких цепочек. Строгий анаэроб. При неблагоприятных условиях образует споры, расположенные субтерминально.

Рост на питательных средах. С. botulinum – строгий анаэроб. Бактерии хорошо растут в жидких средах с добавлением белка (среда Китта-Тароцци): вызывают помутнение среды и газообразование. На печёночном агаре образуют полиморфные звёздчатые колонии, в желатине - сероватые, окружённые зоной разжиженного желатина. Температурный оптимум культивирования – 28-35°С, оптимум рН для роста вегетативных форм 7,3-7,6.

Спорообразование. При неблагоприятных условиях (рН среды, температура, влажность, кислород) вегетативные формы возбудителей ботулизма образуют споры. Они чрезвычайно устойчивы к различным физическим и химическим факторам, в частности, выдерживают кипячение в течение 4-5 ч, воздействие высоких концентраций различных дезинфицирующих средств, сохраняются в продуктах, содержащих до 18% поваренной соли.

Антигенная структура. Имеется соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены. По антигенным свойствам экзотоксина выделяют 7 серологических типов С. botulinum - А, В, С, D, Е, F и G.

Эпидемиология. Возбудитель ботулизма широко распространен в природе. Вегетативные формы и споры обнаруживаются в кишечнике различных домашних и диких животных, птиц, рыб, моллюсков, насекомых. Во внешней среде (почва, ил) споры возбудителя длительно сохраняются. Практически все пищевые продукты, загрязненные почвой или содержимым кишечника животных, птиц, рыб могут содержать споры или вегетативные формы возбудителей ботулизма. Однако заболевание может возникнуть только при употреблении в пищу тех продуктов, которые хранились при анаэробных или близких к ним условиях без предварительной достаточной термической обработки. Это могут быть консервы, особенно домашнего приготовления, копченые, вяленые мясные и рыбные изделия, а также другие продукты, в которых имеются условия для развития вегетативных форм микробов и токсинообразования. В России чаще регистрируются заболевания, связанные с употреблением грибов домашнего консервирования, копченой или вяленой рыбы, в европейских странах - мясных и колбасных изделий, в США - бобовых консервов. В настоящее время преобладают заболевания, обусловленные отравлениями токсинами А, В или Е. Таким образом, основным путем заражения является пищевой, обусловленный употреблением консервированных в домашних условиях продуктов питания.

К редко встречающимся формам заболевания относятся раневой ботулизм и ботулизм младенцев. Раневой ботулизм может возникнуть вследствие загрязнения ран, в которых в дальнейшем создаются условия, близкие к анаэробным, спорами возбудителя. После прорастания спор вегетативные формы начинают продукцию ботулотоксина, который попадает в кровь. Своеобразной формой раневого ботулизма является ботулизм у наркоманов. Заражение осуществляется в результате инъекций или даже накожных скарификаций "черного героина" ("черной смолы"), исходный материал для приготовления которого загрязнен почвой и таким образом контаминирован спорами. В случае абсцедирования мест инъекций развивается заболевание как и при раневом ботулизме.

Ботулизм младенцев наблюдается у детей первых шести месяцев жизни, находящихся на частичном или полном искусственном вскармливании. При расследовании подобных случаев заболевания споры обнаруживали в меде, используемом для приготовления питательных смесей, а также в бытовой пыли помещений и на коже кормящих матерей. Вследствие особенностей микрофлоры кишечника младенцев, попавшие в желудочно-кишечный тракт ребенка споры находят благоприятные условия для прорастания в вегетативные формы и продуцирования токсинов.

Патогенез ботулизма. Главный фактор патогенности С. botulinum – экзотоксин (ботулотоксин), обладающий нейротоксическим действием. Из кишечника токсин поступает в кровь, затем попадает в центральную нервную систему. Молекулы токсина блокируют передачу нервных импульсов на уровне синапсов мотонейронов.

Клинические проявления. Временной интервал между попаданием токсина в организм и появлением первых признаков ботулизма обычно не превышает 24 часов. Первыми симптомами являются тошнота, рвота, боли в животе, головная боль, сухость во рту или наоборот – гиперсаливация. Вскоре появляются симптомы поражения нервной системы: нарушение глотания (дисфагия), односторонний или двусторонний блефароптоз (опущение века), анизокория (разные размеры правого и левого зрачков), диплопия (двоение изображения). Нарушения нервно-мышечной передачи проявляются сначала вялостью движений или полной адинамией с последующим развитием парезов и/или параличей мышц глаза, глотки, гортани, а также мышц шеи и конечностей. Смерть наступает вследствие паралича дыхательной мускулатуры.

Принципы микробиологической диагностики. Цель исследования — обнаружение и идентификация токсина, выделение возбудителя - вторичный этап. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал, полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы), и секционный материал. Кровь исследуют только на наличие токсина, для чего проводят биологическую пробу на мышах; испражнения - только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал - на наличие возбудителя и его токсина.

Идентификация токсинов. Классический метод – реакция нейтрализации токсина - биологическая проба на мышах. Для опыта отбирают партию из 5 животных. Первое заражают только исследуемым материалом, остальных - исследуемым материалом с введением 2 мл 200 МЕ антитоксической сыворотки типов А, В, С и Е. При наличии в материале токсина выживает животное, получившее антисыворотку, нейтрализовавшую токсин соответствующего типа. Для идентификации токсинов также используют РНГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антителами к токсинам соответствующих типов).

Лечение. До установления типа ботулинического токсина, вызвавшего отравление, используют поливалентную (типов А, В, С, Е) лошадиная антитоксическую сыворотку, которую вводят внутривенно.

После идентификации антигенного типа токсина продолжают вводить моновалентную антитоксическую сыворотку.

Профилактика. Для специфической профилактики ботулизма применяют ботулинический полианатоксин, входящий в состав комплексной вакцины для профилактики анаэробных инфекций. Однако в силу спорадичности заболевания иммунопрофилактика ботулизма не нашла широкого применения.

Основу предупреждения случаев ботулизма составляет неукоснительное соблюдение санитарно-гигиенических правил при производстве пищевых продуктов. В частности, консервы в течение определенного времени должны выдерживаться при температуре 37°С. Если продукт инфицирован, споры прорастают, бактерии начинают делиться. Из-за образования газа крышка банки вздувается (бомбаж). Для профилактики ботулизма в консервы вносят различные ингибиторы роста бактерий (например, нитриты в мясные изделия).

Контрольные вопросы по теме занятия: 1. Морфологические, тинкториальные, культуральные свойства и биохимическая активность возбудителей столбняка, анаэробной раневой инфекции, ботулизма. 2. Факторы патогенности возбудителей клостридиозов. 3. Патогенез и клиника клостридиозов. 4. Эпидемиология клостридиозов. 5. Лабораторная диагностика анаэробной раневой инфекции. 6. Неспецифическая и специфическая профилактика газовой гангрены. 6. Специфическая профилактика столбняка. 7. Условия накопления ботулотоксина в продуктах питания.

Литература для подготовки к занятию: Основная литература: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004. Дополнительная литература: 1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002. 2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.