Занятие 23

Тема занятия: Возбудители дифтерии, коклюша, паракоклюша. Характеристика. Патогенез, клиника, лабораторная диагностика вызываемых заболеваний. Специфическая терапии и профилактика.

Учебная цель занятия: Познакомиться с биологическими свойствами возбудителей дифтерии, коклюша, паракоклюша, патогенезом и клиникой вызываемых ими заболеваний, методами лабораторной диагностики дифтерии, коклюша, паракоклюша, с принципами специфической терапии и профилактики указанных инфекций.

Задачи занятия: Познакомиться с методами лабораторной диагностики дифтерии, коклюша, паракоклюша, свойствами возбудителей указанных заболеваний, методами их лабораторной диагностики, средствами профилактики и лечения.

Дифтерия

Дифтерия - острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое про­является глубокой интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя.

Возбудитель дифтерии – Corynebacteriumdiphtheriae - обнаружен впервые в 1883 г. Э. Клебсом.  Получен в чистой культуре в 1884 г. Ф. Лёффлером.

Классификация. Возбудитель дифтерии относится к группе коринеформных бактерий, к роду Corynebacterium, семейству Corynebacteriaceae. Род Corynebacterium включает в себя большое количество видов, которые делят на 3 группы. 1. Коринебактерии - паразиты человека и животных и патогенные для них. 2. Коринебактерии, патогенные для растений. 3. Непатогенные коринебактерии (коринеформные бактерии, дифтероиды). Многие виды коринебактерий являются нормальными обитателями кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных путей, уретры и половых органов. Распространены в воздухе, почве, пыли, воде.

В природе существуют три основных варианта (биотипа) дифтерийной палочки: gravis, intermedius и mitis. Они различаются по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам. Деление дифтерийных бактерий на биотипы было произведено с учетом того, при каких формах течения дифтерии у больных они выделяются с наибольшей частотой. Бактерии биовара gravis – короткие неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул. Биовар mitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие много волютиновых зерен (тельца Бабеша – Эрнста).  Бактерии биовара intermedius наиболее крупные, с бочковидными очертаниями; для них характерны поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов.

Морфология. Дифтерийная палочка (палочка Клебса-Лёффлера) - С. diphtheriae - прямые или слегка изогнутые неподвижные грамположительные палочки длиной 1,0-12,0 мкм и диаметром 0,3-0,8 мкм, спор и капсул не образуют. Очень часто они имеют вздутия на одном или обоих концах, часто содержат метахроматические гранулы - зерна волютина (полиметафосфаты), которые при окрашивании метиленовым синим приобретают голубовато-пурпурный цвет. Для их обнаружения предложен особый метод окрашивания по Нейссеру. При этом палочки окрашиваются в соломенно-желтый цвет, а зерна волютина - в темно-коричневый цвет, и располагаются обычно по полю­сам. В мазках бактерии располагаются в виде “растопыренных пальцев”, “иероглифов”, “паркета”, латинских букв V, Y, L и др. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки.

Культуральные свойства. Дифтерийная палочка является аэробом или факультативным анаэробом, температурный оптимум для роста 35-37°С, оптимальная рН 7,6-7,8. Лучше растет на средах, содержащих сыворотку или кровь. Диагностическими для дифтерийных бактерий являются сывороточные среды Ру и Леффлера, на которых возбудитель растет в виде выпуклых, величиной с булавочную головку колоний серовато-белого или желтовато-кремового цвета. Поверхность их гладкая или слегка зернистая, на периферии колонии несколько более прозрачные, чем в центре. Колонии не сливаются, вследствие чего культура приобретает вид шагреневой кожи. На бульоне рост проявляется в виде равномерного помутне­ния, либо бульон остается прозрачным, а на его поверхности образуется нежная пленка, которая постепенно утолщается, крошится и хлопьями оседает на дно. Хорошо растут на средах с теллуритом калия.

Биохимическая активность. С. diphtheriae разлагают глюкозу, мальтозу, галактозу с образованием кислоты без газа, но не ферментируют сахарозу, имеют цистиназу, не имеют уреазы и не образуют индола. По этим признакам они отличаются от тех коринебактерий, которые часто встречаются на слизистой оболочке глаза (С. xerosis), носоглотки (С. pseudodiphteritium).

Резистентность. С. diphtheriae проявляет большую устойчивость к низким температурам, но быстро погибает при высокой температуре: при 60°С - в течение 15-20 минут, при кипячении - через 2-3 минуты. В высушенных пленках выдерживает температуру 98°С в течение 1 часа, а при комнатной температуре может сохраняться до 7 месяцев. На игрушках сохраняется до 2 недель в пыли – до 5 недель, в воде и молоке – до 6-20 суток. Все дезинфицирующие вещества уничтожают возбудитель за 5-10 минут. Возбудитель дифтерии хорошо переносит высушивание и долго сохраняется в высохшей слизи, слюне, в частичках пыли.

Факторы патогенности: Экзотоксин. Дифтерию вызывают  штаммы С. diphtheriae, которые несут в своем геноме гены умеренного бактериофага. Утрата клеткой профага делает клетку мало токсигенной. Напротив, лизогенизация нетоксигенных С. diphtheriae конвертирующим фагом превращает их в токсигенные бакте­рии. Дифтерийный экзотоксин в организме больных оказывает избирательное и специфи­ческое воздействие на определенные системы (сердце, сосуды и периферические нервы). Дифтерийный экзотоксин представляет собой полипептид. Он термолабилен –  разрушается при 56 - 60°С в течение 1 – 2 часов, при 80°С - в течение нескольких минут. Инактивация токсина происходит под влиянием прямого солнечного света, УФ лучей (в течение 1 – 2 часов), кислорода воздуха. При добавлении к токсину 0,3 – 0,4% формалина и инкубации смеси в течение месяца при 38 - 40°С токсин превращается в анатоксин (токсоид). Токсин состоит из двух фрагментов – А и В. Фрагмент В обеспечивает адсорбцию и проникновение фрагмента А в клетку. Синтез фрагмента А кодируется бактериальными генами, фрагмента В – генами фага.

Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий используют следующие способы:

• Метод преципитации в геле. Полоску стерильной фильтровальной бумаги смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой и наносят на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15-20 минут. Испытуемые культуры засевают бляшка­ми по обе стороны от полоски фильтровальной бумаги. Чашки с посевами инкубируют при 37°С, результаты учитывают через 24-48 часов. Результатом взаимодействия токсина и антитоксина (антитоксических антител) является образование в геле четкой линии преципитации.

• Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения. Наиболее характерным проявлением действия токсина является поражение надпочечников.

• Заражение куриных эмбрионов - дифтерийный токсин вызывает их гибель.

• Заражение культур клеток - дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.

• Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.

• Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения tox-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.

Эпидемиология. Резервуар инфекции – человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель). Единственным источником заражения является человек - больной, выздоравливающий или бактерионоситель.

Пик заболеваемости приходит на осенне-зимний период. Заражение происходит воздушно-капельным, воздушно-пылевым путем, а также через различные предметы, бывшие в употреблении у больных или бактерионосителей: посуда, книги, белье, игрушки и т. п. В случае инфицирования пищевых продуктов (в основном, молочные продукты) возможно заражение алиментарным путем. Наиболее массивное выделение возбудителя имеет место при острой форме заболевания. Однако наибольшее эпидемиологическое значение имеют лица со стертыми, нетипичными формами заболевания и бактерионосители. Больной дифтерией заразен в течение острого периода и в начале периода реконвалесценции. Средний срок бактерионосительства у выздоравливающих варьирует от 2 до 7 недель, но может продолжаться и до 3 месяцев.

Особенности патогенеза и клиники. К дифтерии восприимчивы люди любого возраста. Возбудитель может проникнуть в организм человека через слизистые оболочки различных органов или через поврежденную кожу. В зависимости от локализации процесса различают дифтерию зева, носа, гортани, уха, глаз, половых органов и кожи. Возможны смешанные формы, например дифтерия зева и кожи и т. п.

Инкубационный период - 2-10 дней. При клинически выраженной форме дифтерии в месте локализации возбудителя развивается характерное фибринозное воспаление слизистой оболочки. Токсин, вырабатываемый возбудителем, сначала поражает эпителиальные клетки, а затем - близлежащие кровеносные сосуды, повышая их проницаемость. Вследствие отека слизистой оболочки гортани и голосовых связок может наступить удушье (истинный круп). Действие экзотоксина приводит к образованию на поверхности слизистых оболочек пленчатых налетов серовато-белого цвета. На многослойном плоском эпителии носоглотки образуется дифтеритическая пленка плотно спаянная с подлежащей тканью.  На цилиндрическом эпителии трахеи и бронхов образуется крупозная пленка, которая легко отделяется при кашле. Попадание крупозной пленки в голосовую щель вызывает рефлекторный спазм голосовых связок и удушье (ложный круп). Постинфекционный иммунитет прочный, стойкий, фактически пожизненный.

Лабораторная диагностика. 1. Бактериоскопия при окраске по Граму, по Нейссеру. 2. Культивирование: - посев на элективные среды с теллуритом (Клауберга II или Маклеода) – восстановление теллурита дифтерийной палочкой; - выделение чистой культуры на скошенном сывороточном агаре; - проба Пизу; - укороченный пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина); - способность к росту в анаэробных условиях в столбике 0,5% сахарного агара (растет только дифтерийный микроб). 

Основным методом лабораторной диагностики дифтерии является бактериологический, с обязательной проверкой выделенной чистой культуры на токсигенность. Бактериологическому исследованию на дифтерию подлежат: - дети и  взрослые с  острыми  воспалительными  процессами в области зева, носа, носоглотки; - лица, находившиеся в контакте с источником возбудителя дифтерии; - лица, поступающие в детские дома, ясли, школы-интернаты.

Материалом для исследования служат слизь из зева и носа, пленка с миндалин или других слизистых оболочек, являющихся местом входных ворот возбудителя. Посевы производят на теллуритовые сывороточные или кровяные среды и одновременно на свернутые сывороточные среды Ру или Леффлера. Выделенную культуру идентифицируют по совокупности морфологических, культуральных и биохимических свойств, по возможности используют методы серотипирования и фаготипирования. Во всех случаях обязательна проверка на токсигенность.

Лечение. Специфическим средством лечения дифтерии является внутримышечное применение противодифтерийной антитоксической сыворотки, применение антибиотиков (пенициллины, тетрациклины, эритромицин и др.) и сульфаниламидных препаратов. С целью стимулирования выработки собственных антитоксинов можно использовать анатоксин.

Специфическая профилактика. С этой целью используют различные варианты вакцин, в том числе комбинированные. Наибольшее распространение в России получила вакцина АКДС (АДС, АДС-М). Она представляет собой адсорбированную на гидроокиси алюминия смесь убитых коклюшных бактерий, дифтерийного анатоксина и столбнячного анатоксина. Вакцинируют детей с 3-месячного возраста, а затем проводят ревакцинации: первую через 1,5-2 года, последующие в возрасте 9 и 16 лет, а далее через каждые 10 лет.

Коклюш и паракоклюш

Коклюш - острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, характеризующееся циклическим течением и приступообразным спазматическим кашлем.

Возбудитель - Bordetellapertussis - впервые был обнаружен в 1900 г. в мазках из мокроты ребенка и затем выделен в чистой культуре в 1906 г. Ж. Борде и О. Жангу. Возбудитель сходного с коклюшем, но протекающего более легко паракоклюша -Bordetellaparapertussis - был выделен и изучен в 1937 г. Г. Эльдерингом и П. Кендриком и независимо от них в 1937 г. У. Брэдфордом и Б. Славиным. Род Bordetellaотносится к семейству Brucellaceae. Бактерии названы в честь бельгийского бактериолога Ж. Борде.

Характеристика возбудителя. Бордетеллы грамотрицательные. Иногда выявляется биполярная окраска за счет зерен волютина на полюсах клетки. Возбудитель коклюша имеет форму овоидной палочки (коккобактерии) размером 0,2-0,5x1,0-1,2 мкм. Паракоклюшная палочка имеет такую же форму, но несколько крупнее (0,6x2 мкм). Расположены чаще поодиночке, но могут располагаться попарно. Спор не образуют, у молодых культур и у бактерий, выделенных из макроорганизма, обнаруживается капсула. Бордетеллы неподвижны, за исключением Bordetellabronchiseptica, которая является перитрихом.

Бордетеллы - строгие аэробы. Оптимальная температура роста - 35-36°С. Возбудитель коклюша в гладкой S-форме (так называемая фаза I), в отличие от двух других видов бордетелл, не растет на МПБ и МПА. Для выращивания коклюшной палочки используется среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар с добавлением крови), на ней она растет в виде гладких, блестящих, прозрачных куполообразных с жемчужным или металлическим ртутным оттенком колоний. На казеиново-угольном агаре (КУА) вырастают гладкие выпуклые колонии, имеющие серовато-кремовый цвет и вязкую консистенцию. Колонии паракоклюшных бактерий по внешнему виду не отличаются от коклюшных, но крупнее.

Характерной особенностью коклюшных бактерий является их наклонность к быстрому изменению культуральных и серологических свойств при изменении состава питательной среды, температуры и других условий выращивания. В процессе перехода от S-формы (фаза I) к стабильной шероховатой R-форме (фаза IV) через промежуточные фазы II и III наблюдаются плавные изменения антигенных свойств; патогенные свойства теряются.

Бордетеллы не ферментируют углеводов, не образуют индола, не восстанавливают нитраты в нитриты (за исключением Bordetellabronchiseptica).

Бордетеллы содержат несколько антигенных комплексов (агглютининов и т. д.). Соматический 0-антиген является видоспецифическим; родовым антигеном является агглютиноген 7.

Факторы патогенности: - микроворсинки (пили, фимбрии); - термолабильный экзотоксин (коклюшный токсин); - термостабильный эндотоксин; - денилатциклаза; - цитотоксин; - гистаминсенсибилизирующий фактор; - гемагглютинин; - гиалуронидаза; - плазмокоагулаза.

Эпидемиология. Источник инфекции при коклюше и паракоклюше – больной человек типичной или стертой формой, особенно в период до появления спазматического кашля. Механизм заражения - воздушно-капельный. Бордетеллы обладают специфическим тропизмом к цилиарному эпителию респираторного тракта хозяина. К инфекции восприимчивы люди всех возрастов, но более всего дети от 1 года до 10 лет.

Патогенез и клиника. Инкубационный период при коклюше от 3 до 14 дней, чаще - 5-8 дней. Возбудитель, попавший на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, размножается в клетках цилиарного эпителия и далее бронхогенным путем распространяется в более низкие отделы (бронхиолы, альвеолы, мелкие бронхи). При действии экзотоксина эпителий слизистой оболочки некротизируется, в результате чего раздражаются кашлевые рецепторы, и создается постоянный поток сигналов в кашлевой центр продолговатого мозга, в котором формируется стойкий очаг возбуждения. Это приводит к возникновению спазматических приступов кашля. Бактериемии при коклюше не бывает.

В течении заболевания выделяют следующие стадии: - катаральный период, длящийся около 2 недель и сопровождающийся сухим кашлем; состояние больного постепенно ухудшается; - конвульсивный (судорожный), или спазматический период, длящийся до 4-6 недель и характеризующийся возникающими до 20-30 раз в сутки приступами неукротимого “лающего” кашля, причем приступы могут быть спровоцированы даже    неспецифическими    раздражителями    (свет,    звук,    запах,    медицинские манипуляции, осмотр и т. д.); - период разрешения, когда приступы кашля становятся реже и все менее продолжительными, отторгаются некротизированные участки слизистой оболочки верхних   дыхательных   путей,   часто   в   виде  “слепков”   с   трахеи   и   бронхов; продолжительность - 2-4 недель.

Стадии болезни: - катаральная стадия; - пароксизмальная стадия; - стадия выздоровления.

Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется стойкий пожизненный гуморальный иммунитет. У больных коклюшем и переболевших в крови накапливаются агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела.

Лабораторная диагностика. Основными методами диагностики являются бактериологический и серологический. Для выделения чистой культуры в качестве материала используют слизь из носоглотки или мокроту, которые высевают на КУА или среду Борде-Жангу. Посев также может быть сделан методом “кашлевых пластинок”. Выросшую культуру идентифицируют по совокупности культуральных, биохимических и антигенных свойств.

Специфическая профилактика и лечение. Для проведения плановой профилактики коклюша у детей используют адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС), где коклюшный компонент представлен убитыми коклюшными бактериями. Из этого же компонента состоит выпускающаяся отдельно убитая коклюшная вакцина, применяемая в детских коллективах по эпидемиологическим показаниям. Для лечения применяют антибиотики (гентамицин, ампициллин), которые эффективны в катаральном периоде и не эффективны в судорожном периоде заболевания.

Контрольные вопросы по теме занятия: 1.Морфологические, тинкториальные, культуральные свойства и   биохимическая активность возбудителей дифтерии, коклюша, паракоклюша. 2. Факторы патогенности возбудителей дифтерии, коклюша, паракоклюша. 3. Антигенная структура возбудителей дифтерии, коклюша, паракоклюша. 4. Патогенез и клиника дифтерии, коклюша, паракоклюша. 5. Эпидемиология дифтерии, коклюша, паракоклюша. 6. Клиническая картина дифтерии, коклюша, паракоклюша. 7. Лабораторная диагностика дифтерии, коклюша, паракоклюша. 8. Лечение и профилактика дифтерии, коклюша, паракоклюша.

Литература для подготовки к занятию: Основная литература: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература: 1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002. 2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005. 3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.