Занятие 24

Тема занятия: Возбудитель туберкулеза. Биологические свойства. Патогенез и клиника туберкулеза. Принципы лабораторной диагностики. Специфическая профилактика.

Учебная цель занятия: Изучение биологических свойств возбудителя туберкулеза, патогенеза и клиники вызываемого заболевания, методов лабораторной диагностики, принципов терапии и специфической профилактики туберкулеза.

Задачи занятия: Познакомиться с основными свойствами возбудителя туберкулеза, методами лабораторной диагностики заболевания, средствами специфической профилактики и лечения туберкулеза.

Туберкулез (лат. tuberculum - бугорок) – инфекционное заболевание человека, сопровождающееся специфическим поражени­ем различных органов и систем (органов дыхания, лимфатических узлов, кишечника, костей и суставов, глаз, кожи, почек, мочевыводящих путей, половых органов, ЦНС).

Таксономия. Возбудители туберкулеза от­носятся к семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium (греч. myces - гриб и bacteria - палочка).  Туберкулез у человека вызывают микобактерии, относящиеся к 3 видам: Mycobacteriumtuberculosis - чело­веческий вид (вызывает 92% случаев туберкулеза), Mycobacteriumbovis - бычий вид (5% случаев), Mycobacteriumafricanum - промежуточный вид (3% случаев).

Бактериальная природа туберкулеза установлена в 1882 г. Р. Кохом, обнаружившим в туберкулезных очагах возбудителя и получившим его чистую культуру. Им же в 1890 г. был получен туберкулин, сыгравший большую роль в диагностике туберкулеза. В 1911 г. Р. Кох за открытие возбудителя туберкулеза был удостоен Нобелевской премии.

Морфология и тинкториальные свойства. Возбудители туберкулеза характеризуются выраженным поли­морфизмом. Полиморфизм возбудителей туберкулеза проявляется в образовании различных морфоваров: кокковидных, нитевидных, ветвис­тых, колбовидных вариантов, а также L-форм бактерий, которые образуются в процессе лечения, но длительно персистируют в макроорганизме внутриклеточно в макрофагах, индуцируя противотуберкулезный иммунитет. Они имеют форму длинных, тонких (М. tuberculosis, М. africanum) или более коротких и толстых (М. bovis) прямых или слегка изогнутых палочек с гомогенной или зернистой цитоплазмой, содержащей от 2 до 12 зерен различной величины, состоящих из липидов или метафосфатов. Грамположительные, неподвижные, спор не образуют. Имеют микрокапсулу. Плохо воспринимают анилиновые красители. Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена, в основу которого положен принцип термокислотного протравливания. В таких препаратах микобактерии обнаруживаются в виде ярко-красных кислотоустойчивых палочек, расположенных одиночно или небольшими скоплениями из 2-3 клеток, образующими римскую цифру V.

Культуральные свойства. М. tuberculosis относится к аэробам, характеризуется медленным ростом. Они требовательны к питательным средам, глицеринзависимые. Им нужны факторы роста: витамины группы В, аспарагиновая и глютаминовая аминокислоты, глицерин и глюкоза. Стимулятором их роста является лецитин. Для подавления токсического действия образуемых в процессе метаболизма жирных кислот к средам добавляют активированный уголь, сыворотки крови животных и альбумин, а для подавления роста сопутствующей микрофлоры - красители (малахитовый зеленый) и антибиотики, не действующие на микобактерии. Оптимальная температура культивирования 37-38°С, рН 6,8-7,2. Рост и размножение происходят путем простого деления или путем почкова­ния. В жидких средах через 5-7 дней образует на поверхности толстую сухую морщинистую пленку кремового цвета. На плотных средах рост отмечается на 15-30-й день в виде колоний R-формы, которые по мере роста принимают бородавчатый вид, напоминая цветную капусту. Из экспериментальных животных к М. tuberculosis наибольшей восприимчивостью обладают морские свинки, у которых при подкожном заражении возникает генерализованная инфекция, заканчивающаяся гибелью животных через 2-3 месяца.

Для культивирования возбудителей туберкулеза применяют плотные элективные среды: яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финна 2, агаровые среды Миддлбрука, жидкую среду Дюбо, полусинтетическую среду Школьниковой, синтетическую среду Сотона и др. В качестве стандартных сред используют среду Левенштейна-Йенсена и среду Финна 2.

Для экспресс-диагностики используют метод микрокультивирования на стеклах в жидкой среде (метод микрокультур Прайса), при котором через 48-72 часа отмечается рост микобактерий в виде переплетенных девичьих “кос” или “жгутов” благодаря корд-фактору (англ. cord - жгут, веревка). Корд-фактор - это гликолипид, состоящий из трегалозы и димиколата, относится к факторам патогенности микобак­терий.

Биохимические свойства. У возбудителей туберкулеза обнаружены ферменты аминотрансферазы, эстеразы, трегаллазы. Внутриклеточное дыхание микобактерий осуществляют оксидоредуктазы, из которых особый интерес представляют каталаза и пероксидаза, так как с ними связана вирулентность возбудителей. Микобактерии в большом количестве образует никотиновую кислоту (ниацин), которая на­капливается в жидкой питательной среде и дает с раствором цианида калия и хлорамином Б ярко-желтое окрашивание (ниациновая проба Конно).

Химический состав, антигенная структура и факторы патогенности. Основными химическими компонентами микобактерий являются белки (туберкулопротеины), углеводы и липиды. Туберкулопротеины составляют 56% сухой массы вещества микробной клетки. Они являются основными носителями антигенных свойств микобактерий, высокотоксичны, вызывают развитие реакции гиперчувствительности 4-го типа.

На долю полисахаридов приходится 15% сухой массы вещества микобактерий. Это родоспецифические гаптены.

На долю липидов (фтионовая кислота, масляная, пальмитиновая, туберкулостеариновая и другие жирные кислоты, а также корд-фактор и воск Д, в состав которого входит миколовая кислота) приходится от 10 до 40 % сухой массы вещества микобактерий. Вирулентные микобактерии содержат липидов больше, чем кислотоустойчивые сапрофиты Миколовая кислота, входящая в состав липидных комплексов, обуславливает кислото-, спирто- и щелочеустойчивость возбудителя туберкулеза. Липиды вызывают развитие гранулем и казеозного некроза, экранируют клетку, подавляют активность фагоцитов.

Устойчивость в окружающей среде. Благодаря наличию липидов, микобактерии обладают гидрофобной клеточной стенкой, что делает их устойчивыми в окружающей среде к действию неблагоприятных факторов. При отсутствии солнечного света их жизнеспособность сохраняется в течение нескольких месяцев, при рассеянном свете возбудители погибают через 1-1,5 месяца. В уличной грязи они сохраняются до 4 месяцев, в речной воде - до 7 месяцев, в сточной воде - до 15 месяцев, в почве, особенно на скотном дворе, в навозе - 2 года. Облученная сол­нечным светом культура погибает в течение 1,5 часа, а под воздействием ультрафиолетовых лучей - через 2-3 минуты. При кипячении микобактерии туберкулеза погибают через 5 минут, а при пастеризации - в течение 30 минут. Возбудители туберкулеза устойчивы к действию дезинфицирующих веществ. Для дезинфекции используются хлорсодержащие препараты, вызывающие гибель возбудителей туберкулеза в течение 3-5 часов.

Эпидемиология, патогенез и клиника тубер­кулеза. Туберкулез распространен повсеместно и является социальной проблемой здравоохранения. Росту заболеваемости туберкулезом способствуют не только неблагоприятные социально-экономические факторы, но и широкое распространение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью к антибиотикам.

Основным источником инфекции является больной туберкулезом органов дыхания, выделяющий микробы в окружающую среду с мокротой. Больные сельскохозяйственные животные (крупный рогатый скот, верблюды, свиньи, козы и овцы), а также люди, страдающие внелегочными формами заболевания, играют второстепенную роль.

Основной механизм заражения при туберкулезе - аэрогенный с соответствующими ему воздушно-капельным и воздушно-пылевым путями передачи инфекции. Входными воротами при этом могут быть слизистая оболочка полости рта, миндалины, бронхи и легкие. Реже заражение туберкулезом может происходить пищевым путем при употреблении термически не обработанных мясомолочных продуктов. Возможен контактный путь передачи инфекции от больных туберкулезом через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки при использовании инфицированной одежды больных, игрушек, книг, посуды и других предметов. Известны случаи заражения людей при уходе за больными животными. Описаны редкие случаи заражения у хирургов, патологоанатомов, мясников. Трансплацентарный путь передачи также возможен, но, как правило, не реализуется вследствие тромбоза кровеносных сосудов плаценты в местах поражения.

Инкубационный период длится от 3-8 недель до 1 года и более (до 40 лет). Возбудитель в течение длительного времени сохраняется в “дремлющем” состоянии в фагоцитирующих клетках регионарных лимфатических узлов. В развитии заболевания выделяют первичный туберкулез, диссеминированный и вторичный туберкулез, который, как правило, является следствием активации старых эндогенных очагов. Развитие вторичного туберкулеза возможно также в результате нового экзогенного заражения возбудителями туберкулеза (суперинфекция) вследствие тес­ного контакта с бактериовыделителем, что также вероятно при неблагоприятных социально-экономических условиях.

Первичный туберкулез возникает у ранее неинфицированных людей и характеризуется выраженными токсико-аллергическими осложнениями и некротическими изменениями в тканях, возникающими на фоне высокой чувствительности макроорганизма к возбудителям туберкулеза. Для него характерна гематогенная диссеминация. Вторичный ту6еркулез возникает в иммунном организме у ранее инфицированных людей, поэтому процесс локализуется, как правило, в каком-либо одном органе. Для него не характерна гематогенная диссеминация.

Попавшие в организм микобактерии поглощаются макрофагами и переносятся в регионарные лимфатические узлы (незавершенный фагоцитоз). В результате бактериемии возбудители туберкулеза разносятся по макроорганизму, что ведет к сенсибилизации тканей и органов. В ряде случаев дан­ный процесс может сопровождаться развитием первичной туберкулезной интоксикации у детей и подростков.

При попадании больших доз высоковирулентного микроба в месте входных ворот инфекции происходит развитие специфического туберкулезного воспаления, сопровождающегося образованием первичного туберкулезного комплекса, состоящего из первичного аффекта или воспалительного очага (в легких это пневмонический очаг под плеврой), воспаленных лимфатических сосудов (лимфангоит), идущих от первичного аффекта, и пораженных регионарных лимфатических узлов (лимфаденит). Из первичного туберкулезного комплекса может происходить бронхогенная, лимфогенная, а также гематогенная диссеминация микобактерий с образованием очагов в других органах и тканях (диссеминированный лёгочный и внелёгочный туберкулез).

В последующем происходит заживление очага, воспаление рассасывается, а некротические массы уплотняются и обызвествляются вследствие отложения солей кальция (происходит образование петрификата). Вокруг очага формируется соединительнотканная капсула. Такой очаг в легких называется очагом Гона. При формировании очага происходит трансформация микобактерии в L-формы, персистирующие в макроорганизме. При снижении резистентности организма происходит активация процесса и развитие вторичного туберкулеза.

Клинические проявления туберкулеза разнообразны. Различают 3 клинические формы заболе­вания: - первичная туберкулезная интоксикация у детей и подростков; - туберкулез органов дыхания; - туберкулез других органов и систем. Чаще всего возникает туберкулез органов дыхания (легких и внутригрудных лимфатических узлов). Он проявляется субфебрильной температурой тела, кашлем с мокротой, кровохарканьем, одышкой и другими симптомами. Симптомов, характерных только для туберкулеза, нет.

Противотуберкулезный иммунитет формируется в ответ на проникновение в организм микобактерий в процессе инфекции или вакцинации и носит нестерильный, инфекционный характер, что обусловлено длительной персистенцией L-форм бактерий в макроорганизме. Он проявляется через 4-8 недель после попадания микробов в макроорганизм.

Микробиологическая диагностика. Материалом для исследования служат мокрота, промывные во­ды бронхов, плевральная и цереброспинальная жидкости, моча, асцитическая жидкость, а также кусочки тканей и органов, взятые на исследование во время операции или биопсии. Чаще всего исследуют мокроту.

Основными методами микробиологической диагностики туберкулеза являются бактериоскопическое и бактериологическое исследование, биологическая проба, а также туберкулинодиагностика в виде внутрикожного теста с туберкулином.

Бактериоскопическое исследование заключа­ется в многократном проведении прямой мик­роскопии мазков из исследуемого материала, окрашенных по Цилю-Нильсену. В препара­тах можно обнаружить единичные микроорганизмы, если в 1 мл мокроты их содержится не менее 10000-100000 бактериальных клеток (предел метода). При получении отрицательных результатов прибегают к методам обогащения материала: флотации и гомогенизации (седиментации). Для этого мокроту гомогенизируют, затем добавляют углевод (ксилол, толуол или бензин) и встряхивают в течение 10-15 минут. Добавляют дистиллированную воду и оставляют стоять на 1-2 часа при комнатной температуре. Капельки углевода адсорбируют микобактерии и всплывают, образуя кольцо на поверхности. Из этого кольца готовят препараты и окрашивают по Цилю-Нильсену. Так как бактериоскопическое исследование не позволяет определить видовую принадлежность микобактерии, оно относится к ориентировочным методам диагностики и должно сочетаться с другими методами исследования.

Бактериологическое исследование проводят путем высева исследуемого материала на 2-3 различные по составу питательные среды одновременно. В качестве ускоренных методов бактериологической диагностики, сократить время выделении и идентификации туберкулеза до 7-14 дней, применяют метод микрокультур (метод Прайса), а также полностью автоматизированные коммерческие системы бульонного культивирования ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВасТ. При получении отрицательных результатов бактериоскопического и бактериологического исследований проводят выявление возбудителя туберкулеза с помощью биологической пробы на морских свинках.

Туберкулинодиагностика основана на опреде­лении повышенной чувствительности макро­организма к туберкулину с помощью кожных аллерги­ческих проб. Туберкулин - это общее название препаратов, полученных из микобактерии человеческого или бычьего типов. К ним относятся старый туберкулин Коха - АТК (Alt Tuberculin Косh); сухой очищенный туберкулин - РРD (Purified Protein Derivative); очищенный туберкулин в стандартном разведении, разработанный М. А. Линниковой, - РРD-L.

При проведении массового обследования с целью своевременного выявления первичного инфицирования детей и подростков применяется внутрикожная проба Манту. Результаты пробы оцениваются через 48-72 часа. Реакция считается положительной при наличии выраженного инфильтрата (папулы) диаметром 5 мм и более. Проба свидетельствует не о заболевании, а об инфицировании.

Проба отрицательная у здоровых неинфицированных лиц, а также у больных промежуточ­ными формами туберкулеза. Если у взрослых положительная реакция свидетельствует об инфицировании, то у детей, ранее не реагировавших на туберкулин, появление положительной реакции (вираж туберкулиновых проб) указывает на недавнее заражение и служит показанием для проведения лечебных мероприятий.

Дня экспресс-диагностики туберкулеза применяют РИФ с использованием видоспецифических моноклональных антител, метод лазерной флюоресценции, микробиочипы, а также ПЦР, позволяющую сократить исследования до 2 суток.

Препараты для лечения. Антибиотикотерапия - это основной метод лечения больных туберкулезом. В настоящее время по степени эффективности противотуберкулезные препараты делятся на 3 группы: группа А – изониазид и рифампицин, а также их производные; стрептомицин, канамицин, этионамид (протионамид), этамбутол, пиразинамид, флоримицин, циклосерин, производные фторхинолонов; группа С - ПАСК и тиоцетозон (тибон).

Препараты для специфической профилактики. Специфическую профилактику осуществляют путем введения живой вакцины ВСG (Bacille Calmette -Guerin), полученной А. Кальметгом и К. Гереном путем длительного культивирования М. bovis на картофельно-глицериновом агаре с добавлением бычьей желчи (штамм ВСG-1). Вакцинацию проводят у новорож­денных на 3-7-й день жизни внутрикожно с последующей ревакцинацией в соответствии с утвержденным календарем прививок.

Контрольные вопросы по теме занятия: 1. Морфологические, тинкториальные, культуральные свойства и биохимическая активность возбудителей туберкулеза. 2. Факторы патогенности возбудителей туберкулеза. 3. Химический состав возбудителей туберкулеза. 4. Патогенез и клиника туберкулеза. 5. Эпидемиология туберкулеза. 6. Лабораторная диагностика туберкулеза. 7. Туберкулинодиагностика. 8. Лечение и профилактика туберкулеза.

Литература для подготовки к занятию: Основная литература: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004. Дополнительная литература: 1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002. 2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005. 3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.