Занятие 4 Ферменты. Свойства. Механизм действия.

1. Цель занятия

2. 1. Исходя из химической природы ферментов, понять их строение, свойства, механизм действия простых и сложных ферментов.

2. Понять принципы качественного и количественного определения активности ферментов в биологических жидкостях, тканях или их экстрактах.

3. Исследовать зависимость ферментативной активности от t° и pН среды на примере реакции, катализируемой a-амилазой.

4. Научиться анализировать полученные результаты, сформулировать понятия об оpt t° и pН среды для работы фермента и уметь объяснить причины различной активности a- амилазы в условиях разного t° режима и pН среды.

5. Получить представление о возможности использования знаний о свойствах ферментов в медицинской практике.

Вопросы для подготовки к занятию

1. Химическая природа ферментов. Изоферменты (на примере ЛДГ и МДГ). Проферменты (зимогены). Мультиферментные комплексы.

2. Структурно - функциональная организация ферментных белков: активный центр, его свойства. Контактный и каталитический участки активного центра ферментов.

3. Кофакторы ферментов: химическая природа, классификация, роль в биологическом катализе. Роль витаминов в построении кофакторов. Коферменты и простетические группы.

4. Общие свойства ферментов: зависимость активности ферментов от реакции среды и температуры: биологическое и медицинское значение этих свойств ферментов. Специфичность действия ферментов. Виды специфичности. Биологическое значение специфичности действия ферментов.

5. Регуляторные (аллостерические) центры ферментов. Аллостерические модуляторы ферментов. Зависимость активности ферментов от конформации белков.

6. Механизм действия ферментов. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и фермента. Константа Михаэлиса.

7. Активаторы и ингибиторы ферментов: химическая природа, виды активирования и ингибирования ферментов. Биологическое и медицинское значение активаторов и ингибиторов ферментов.

8. Номенклатура и классификация ферментов.

9. Принципы количественного и качественного определения активности ферментов. Единицы активности.

10. Определение активности ферментов в диагностике заболеваний.

11. Применение ферментов как лекарственных препаратов.

Практическая часть Специфичность действия ферментов

Специфичность действия ферментов можно наблюдать на примере амилазы слюны, субстратом для которой является крахмал или гликоген.

Амилаза расщепляет крахмал через стадию декстринов до редуцирующего дисахарида – мальтозы.

О действии фермента можно судить или по исчезновению (расщеплению) субстрата или по образованию конечных продуктов его расщепления.

Принцип метода: a-амилаза слюны катализирует гидролиз a-1-4 гликозидных связей в крахмале и гликогене, что приводит к расщеплению (убыли) субстрата и появлению продуктов гидролиза – декстринов и дисахарида мальтозы. Определяя убыль субстрата (крахмала) с помощью реакции с реактивом Люголя (раствор йода в KI), судят о наличии в слюне фермента амилазы. Крахмал открывается пробой Люголя. Как известно, крахмал со свободным иодом дает синее окрашивание.

Конечные продукты расщепления крахмала можно обнаружить с помощью редуцирующих проб, например, пробой Фелинга. Реакция основана на способности углеводов восстанавливать металлы. При нагревании голубой гидрат окиси меди восстанавливается углеводом сначала в гидрат закиси меди желтого цвета, а при дальнейшем нагревании в закись меди кирпично-красного цвета.

Химизм реакции:

a-амилаза a-амилаза

( С₆ Н₁₀ О₅)_n +н₂о декстрины +н₂о _n(С₁₂ Н₂₂ О₁₁)

крахмал мальтоза

Ход работы:

В пробирку 1 отмерить 2 мл 0,5 раствора крахмала, в пробирку 2 – 2 мл 2% раствора сахарозы. В обе пробирки добавить по 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Пробирки встряхнуть и поместить в термостат или водяную баню при температуре 38°С на 10 минут. После этого с содержимым каждой пробирки проделать пробы Фелинга и Люголя. Для контроля провести с 0,5 % раствором крахмала пробу Люголя и пробу Фелинга с 2% раствором сахарозы.

N пробирки	Источник фермента	Субстрат	Реакция с раствором Люголя (окраска)	Проба Фелинга	Вывод