Занятие 15 внутриклеточный обмен аминокислот

• Цель занятия. Изучить общие пути катаболизма аминокислот (превращения по аминогруппе, превращения по карбоксильной группе, превращения по углеродному скелету); узнать основные механизмы образования аммиака в организме, причины его токсичности и пути обезвреживания

Вопросы для подготовки к занятию

1. Основные пути поступления и использования аминокислот в организме человека.

2. Общие пути превращения аминокислот. Катаболические превращения аминокислот по NH₂ группе, по СООН группе и по углеродному “скелету”.

3. Трансаминирование (переаминирование). Химизм процесса, характеристика трансаминаз, роль витамина В₆ в трансаминировании.

4. Аланиновая (АлАТ) и аспарагиновая (АсАТ) аминотрансферазы. Клиническое значение определения содержания трансаминаз в крови и тканях.

5. Биологическое значение реакций трансаминирования. Коллекторная функция a-кетоглутарата в процессе трансаминирования.

6. Дезаминирование аминокислот. Виды дезаминирования. Окислительное (прямое) дезаминирование глутамата. Химизм и значение процесса, характеристика фермента.

7. Трансдезаминирование аминокислот (непрямое дезаминирование). Схема процесса. Роль кетоглутарата, глутамата в этом процессе. Биологическое значение трансдезаминирования.

8. Судьба безазотистого остатка аминокислот (кетокислот). Гликогенные и кетогенные аминокислоты. Связь обмена аминокислот с ЦТК.

9. Источники и основные пути образования аммиака.

10. Токсичность и пути обезвреживания NH₃:

а) восстановительное аминирование кетоглутарата;

б) образование амидов (глутамина, аспарагина) и аланина - транспортных форм аммиака;

в) образование солей аммония (аммонигенез в почках); роль глутамина (аспарагина) в образовании солей аммония в почках и поддержании кислотно-основного состояния в организме.

г) биосинтез мочевины. Цикл Кребса-Хензелайта (орнитиновый цикл). Химизм процесса, роль аспартата в этом процессе.

12.Нарушение биосинтеза мочевины. Гипераммониемия. Врожденные ферментные нарушения цикла мочевинообразования (цитрулинемия и аргининемия).

Практическая часть Определение активности алт и аст

Образующаяся в результате переаминирования щавелевоуксусная кислота декарбоксилируется при помощи анилинцитрата и превращается в ПВК. Последнюю определяют в виде 2,4 динитрофенилгидразина. Поскольку реакционная смесь содержит a-кетоглутаровыую кислоту, которая в этих же условиях образует соответствующий гидразон с 2,4 фенилгидразином, пробу экстрагируют толуолом. В толуол переходит только гидразон ПВК, а гидразон a-кг остается в водном растворе. При добавлении к толуоловому экстракту спиртовой щелочи развивается стабильное красно-орнажевое окрашивание. Интенсивность которого пропорциональна концентрации ПВК,. Определяют колориметрически на ФЭКе.

Ход работы. В центрифужные пробирку внести по 0,5 мл субстратов для определения АСТ илиАЛТ, пробирки выдержать в термостате 4-5 минут при температуре 25°С, затем добавить 0,5 мл сыворотки крови и перемешать.Пробы инкубировать в термостате 20 минут при 25°С, после этого добавить 3 капли анилинцитрата, перемешать, оставить при комнатной температуре на 20 минут, в каждую пробирку затем внести по 0,5 мл 0,1% раствора 2,4 динитрофенилгидразина, перемешать, оставить на 5 мин. при комнатной температуре, после добавить насыщенного раствора толуола. Пробирки энергично встряхивают, центрифугируют при 2000 оборотах в тчение 5 минут. К 1,5 мл толуолового экстракта добвить 4,5 мл 2,..5% раствора спиртовой щелочи, перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 минут при комнатной температуре.

Параллельно проводят контрольную пробу, содержащую вместо сыворотки крови 0,5 мл дистиллированной воды.

Окраску опытной пробы колориметрировать на ФЭКе с синим светофильтром в кюветах 10 мм против контрольной пробы.

Активность АСТ иАЛТ вычисляют при помощи калибровочных кривых

Результат:

Вывод: