3.3 Клонування організмів і кліток.

Клітинна інженерія. Поняття про клонування. Природні і штучні клони. Історія клонування організмів. Біологічні і етичні проблеми клонування. Терапевтичне клонування і його перспективи в медицині.

Клітинна інженерія. Поняття про клонування. Термін «клон» походить від грецького слова «klon», що означає гілочка, втеча, нащадок і має відношення, перш за все до вегетативного розмноження. Строго кажучи, навіть вегетативне розмноження мікроорганізмів діленням можна назвати клонуванням.

Клонуванню можна давати багато визначень. Ось деякі найпоширеніші з них: клонування - популяція кліток або організмів подій від загального предка шляхом безстатевого розмноження, причому нащадок при цьому генетично ідентичний своєму предкові. Відтворення організмів що повністю повторюють особину, можливо тільки в тому випадку, якщо генетична інформація матери буде без яких-небудь змін передана дочкам. Але при природному статевому розмноженні цьому перешкоджає мейоз. В ході мейоза незріла яйцеклітина, що має подвійний, або диплоидный набір хромосом - носіїв спадкової інформації - ділитися двічі і в результаті утворюються чотири гаплоидных, з одинарним набором хромосом, клітки. Три з них дегенерируют, а четверта з великим запасом живильних речовин, стає яйцеклітиною. У багатьох тварин вона в силу гаплоидности не може розвиватися в новий організм. Для цього необхідне запліднення. Організм, що розвинувся із заплідненої яйцеклітини, набуває ознак, які визначаються взаємодією материнської і батьківської спадковості. Отже, при статевому розмноженні мати не може бути повторена в потомстві.

Як же всупереч цій строгій закономірності змусити клітку розвиватися тільки з материнським диплоидным набором хромосом? Теоретично вирішення цієї важкої біологічної проблеми знайдене.

Природні і штучні клони. У природі все-таки є випадки клонування людини, це однояйцовые або монозиготные близнята - справжні клони з одним і тим же геномом, що виникають при розділенні однієї зиготы на ранній стадії розвитку. Це завжди тільки обидва хлопчики або обидві дівчатка і завжди дивно схожі один на одного. Відомо також, що ембріон ссавця, у тому числі і людини на найраніших стадіях розвитку, у людини, принаймні, до стадії 8 бластомеров, може бути без видимих негативних наслідків роздільний на окремі бластомеры. З них за певних умов можуть розвинутися ідентичні по своєму генотипу особини, по аналогії з однояйцовыми близнятами, тобто з одного 8-клітинного ембріона можуть народитися 8 хлопчиків або дівчаток абсолютно ідентичних.

У природі широко поширено клонування рослин. Перш за все, це відноситься до вегетативного розмноження, що давно використовується людиною. Річ у тому, що у рослин на відміну від тварин у міру їх зростання, в ході клітинної спеціалізації - диференціювання - клітки не втрачають так звані тотипотентные властивості, тобто, не втрачають своєї здатності реалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі. Тому практично будь-яка рослинна клітка, що зберегла в процесі диференціювання своє ядро, може дати початок новому організму. Ця особливість рослинних кліток лежить в основі багатьох методів генетики і селекції.

При вегетативному розмноженні і при клонуванні гени не розподіляються по потоках, як у разі статевого розмноження, а зберігаються у повному складі протягом багатьох поколінь. Всі організми, що входять до складу певного клона мають однаковий набір генів і фенотипически не розрізняються між собою.

Клітки тварин, диференціюючись, позбавляються тотипотентности, і в цьому, одна з істотних відмінностей від кліток рослин. Як буде показано нижче саме тут головна перешкода для клонування дорослих хребетних тварин.

Історія клонування організмів. Клонування рослин живцями, нирками або бульбами в сільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більш 4-х тис. років. Починаючи з 70-х років нашого сторіччя, для клонування рослин почали широко використовувати невеликі групи, і навіть окремі соматичні клітки. Набагато більшу складність представляє клонування тварин. Перші кроки до клонування тварин були зроблені близько ста років тому зоологом Московського Університету Олександром Тіхоміровим, що відкрив на прикладі тутового шовкопряда партеногенез: розвиток без запліднення в результаті хімічних і фізичних дій. Проте партеногенетические ембріони шовкопряда були нежиттєздатні.

У 30-і роки минулого століття академіком Б. Астауровим проводилася серія досліджень, в результаті яких було підібрано термічну дію, здатну одночасно активувати незапліднене яйце до розвитку і блокувати процес перетворення ядра яйцеклітини з подвійним хромосомним набором в ядро з одинарним набором. Таким чином, були отримані перші генетичні копії. На жаль, і таке потомство відрізнялося низькою життєздатністю. Надалі цей метод був вдосконалений академіком Ст. Струнниковим, роботи якого по клонуванню шовкопряда здобули у результаті світову популярність.

Історія клонування хребетних починається в 40-і роки 20-го століття, коли російський ембріолог професор, Г. Лопашов на жабах розробив метод пересадки ядер, на якому засновані всі сучасні експерименти по клонуванню. Метод полягає у виділенні ядра соматичної клітки і імплантації його в обезъядренную (энуклеированную) яйцеклітину. Стаття, написана по матеріалах цих експериментів, була відправлена до «Журналу загальної біології» в серпні 1948 року. Проте світла вона так і не побачила унаслідок тієї, що відбулася місяцем пізніше за сесію ВАСХНІЛ, що привела до безмежного панування «лысенковщины» в біології. Через декілька років, на початку 50-х вже американські ембріологи Кинг і Бріггс провели досліди, подібні до експериментів Лопашова, і «переоткрыли» метод, чим і прославилися.

Вперше можливість клонування ембріонів хребетних була продемонстрована американськими біологами на жабах на початку 50-х років. Потім в 1962 році зоолог Оксфордського університету Дж. Гердон істотно просунув ці результати, коли в дослідах з південноафриканськими жабами почав використовувати як донора ядер не зародкові клітки, а вже клітки епітелію кишечника пуголовка, що підріс, що цілком спеціалізувалися. Виживали не більше двох відсотків клонованого потомства, та і у тих, що вижили спостерігалися різні дефекти. Проте це був величезний крок вперед по шляху клонування.

Перейти від амфібій до ссавцем виявилося вельми важко, головним чином з тієї причини, що розміри яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у земноводних. Але до кінця 70-х ці труднощі вдалося подолати, так що на початок 80-х були освоєні експерименти по клонуванню ембріонів мишей, а до кінця десятиліття учені почали отримувати важливі результати на ембріонах кроликів і крупних домашніх тварин. Аж до середини 90-х років питання про використання дорослих ссавців як донори ядер кліток практично не ставилося, оскільки учені-біологи займалися головним чином клонуванням ембріонів домашніх тварин, причому експерименти в цій області і по цю пору проходять вельми непросто і з високим рівнем невдач. Тому справді сенсацією стала історія з клонуванням в 1996 році знаменитої нині овечки Доллі в шотландській фірмі PPL Therapeutics (комерційного відділення Розлін Інституту в Едінбургу). Колектив учених, очолюваний Іеном Уїлмутом, продемонстрував, що їм вдалося, використовуючи соматичні клітки дорослої тварини, отримати клональное тварину - вівцю по кличці Доллі. Проте цьому передувала велика робота.

Ще в 1986 році Уїландсин показав, що ембріони овець на 16-клітинній стадії розвитку зберігають тотипотентность. Реконструйовані яйцеклітини, що містять ядра бластомеров 16-клітинних зародків, розвивалися нормально до стадії бластулы в перев'язаному яйцепроводі вівці (у агаровому циліндрі), а після звільнення від агару, пересаджували в матку овцы- другого реципієнта - ще на 60 днів. У іншому випадку донорами служили ядра 8-клітинних зародків і було отримано трьох живих ягнят, фенотип яких відповідав породі овцы- донора.

У 1989 році Сміт і Уїлмут трансплантували ядра кліток 16-клітинного ембріона і ранньої бластулы в позбавлені ядра незаплідненої яйцеклітини овець. У першому випадку було отримано двох живих ягнят, фенотип яких відповідав породі овець - донорів ядер. У другому випадку один що повністю сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породі-донорові. Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних кліток відбувається инактивация деяких важливих для розвитку генів і в результаті ядра бластулы вже не можуть репрограммироваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донори ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони або культивовані in vitro лінії ембріональних кліток, ядра яких володіють тотипотентностью.

Пізніше, в 1993-95 рр., група дослідників під керівництвом Уїлмута отримала клон овець - п'ять ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних кліток. Клітинну культуру отримували таким чином: виділяли мікрохірургічним шляхом ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластулы) і культивували клітки in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні, до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стволових диференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2-3 пасажів, клітки ставали ущільненими і морфологічно схожими з епітеліальними. Ця лінія кліток з 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро і реципиентная цитоплазма знаходилася на схожих стадіях клітинного циклу, зупиняли ділення культивованих клітин TNT4 на певній стадії (G0) і ядра цих кліток пересаджували в энуклеированные яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували в перев'язані яйцепроводи овець. Через шість днів ембріони вимивали з яйцепроводів проміжних реципієнтів і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягали стадії морулы і бластулы і пересаджували їх в матку вівці, - остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося п'ять ягнят (самок), з них дві загинули незабаром після народження, третя у віці десяти днів, а дві що залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячного віку. Фенотіпічеськи всі ягнята були схожі з породою овець, від якої отримували початкову лінію кліток TNT4. Це підтвердив і генетичний аналіз.

Ця робота, особливо в частини культури ембріональних кліток, значне досягнення в клонуванні ссавців. Хоча вона і не викликала особливого інтересу, як стаття того ж Уїлмута із співавторами, опублікована в 1997 році, де повідомлялося, що в результаті використання донорського ядра клітки молочної залози вівці було отримано клональное тварина - вівця по кличці Доллі. Остання робота методично багато в чому повторювала попередні дослідження 1996 року, але в ній учені використовували не тільки ембріональні, але ще і фибробластоподобные клітки (фибробласты - клітини сполучної тканини) плоду і клітки молочної залози дорослої вівці. Клітки молочної залози отримували від 6-річної вівці породи Фінн Дорсет, що знаходиться на останньому триместрі вагітності. Всі три типи клітинних культур мали однакове число хромосом - 54, як завжди у овець. Ембріональні клітки використовували як донорів ядер на 7-9 пасажах культивування, фибробластоподобные клітки плоду на 4-6 пасажах і клітки молочної залози на 3-6 пасажах. Ділення клітин всіх трьох типів зупиняли на стадії G0 і ядер кліток пересаджували в энуклеированные ооциты (яйцеклітини) на стадії метафази II. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцепроводі вівці, але деякі ембріони культивували in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнт виходу морул і бластул при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вищий, ніж при культивуванні в яйцепроводі (тому мабуть, немає строгої необхідності в проміжному реципієнтові і можна обійтися культивуванням in vitro).

Вихід морул і бластул в серії дослідів з культурою кліток молочної залози, був приблизно втричі менше, ніж в двох інших серіях, коли як донори ядер використовували фибробластов плоду або ембріональних кліток. Число живих ягнят порівняно з числом пересаджених в матку остаточного реципієнта морул або бластул було також в два рази нижче. У серії дослідів з клітками молочної залози і 277 реконструйованих яйцеклітин був отриманий тільки один живий ягня, що говорить про дуже низьку результативність такого роду експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семи експериментів живих ягнят, що народилися в трьох серіях, показав, що клітки молочної залози були донорами ядер для одного, фибробласты плоду - для двох і ембріональні клітки для чотирьох ягнят. Вівця Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої була культивована клітка молочної залози вівці породи Фінн Дорсет. Доллі фенотипически не відрізняється від овець цієї породи, але сильно відрізняється від вівці-реципієнта породи шотландська чорноморда. Аналіз генетичних маркерів підтвердив цей результат.

Відносний успіх (Доллі померла від передчасного старіння) авторів цієї роботи, перш за все, зв'язаний з використанням тривалих клітинних культур, оскільки після багатьох пасажів в культурі кліток могли бути відібрані малодиференційовані стволові клітини, які ймовірно і були використані як донори ядер. Велике значення мав також той факт, що автори, враховуючи результат своїх минулих робіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнта і яйцеклітин донора.

Своєю роботою Уїлмут з колегами продемонстрували, що ядра кліток молочної залози дорослої вівці можуть бути за певних умов репрограммированы цитоплазмою ооцита і дати розвиток новому організму. Отримані дані змусили по-новому подивитися на процес клітинного диференціювання. Цей процес, як виявилось, не носить необоротний характер. Абсолютно ясно, що чинники цитоплазми здатні ініціювати розвиток нового організму на основі генетичного матеріалу ядра дорослої повністю диференційованої клітки. Таким чином, біологічний годинник може бути повернені назад, і розвиток організму може початися з генетичного матеріалу дорослої диференційованої клітки, що повністю противоречит раніше загальноприйнятій біологічній догмі.

Якщо результати останньої роботи Уїлмута і співавторів остаточно підтвердяться і буде підвищений коефіцієнт виходу живих тварин при використанні як донори ядер кліток дорослих тварин, то це може мати революційне значення в біотехнології тварин і тваринництві. Клонування дозволить зберегти не тільки генотип цінних і видатних у виробничому відношенні тварин, але і безмежно розмножувати їх.

Клонування високопродуктивних домашніх тварин, зокрема, молочних корів, може провести буквально революцію в сільському господарстві, оскільки тільки цим методом можна створити не окремі екземпляри, а цілі стада елітних корів рекордистів. Це ж відноситься до розмноження видатних спортивних коней, цінних хутрових звірів, збереженню рідкісних і зникаючих тварин в природних популяціях і так далі

Безпрецедентний по своєму масштабу експеримент по масовому клонуванню великої рогатої худоби недавно почався в Китаї. Як повідомляє місцевий друк, в Синьцзян-уйгурськом автономному районі на північному заході країни очікується поява від 20 до 50 клонованих телят. Проект ведеться компанією «Цзіньню» і є найбільшим у своєму роді в світі. У нім також беруть участь Австралія, Канада, США і Великобританія і низка інших країн. Китайські учені вважають, що клонування стане важливим кроком в розвитку тваринництва і поліпшенні племінної роботи.

Впровадження в практику методів міжвидового перенесення ядер може відкрити небачені перспективи для порятунку видів тварин, що знаходяться на межі зникнення. Як показали роботи Т. Домінко і соавт. у 1999 р., энуклеированные ооциты великої рогатої худоби після електрозлиття з ядрами шкірних фибробластов биків (Bos taurus), овець (Ovis aries), свиней (Sus scrofa), мавп (Масаса fascicularis) і щурів (Rattus rattus) можуть підтримувати розвиток ембріонів до ранніх стадій (в деяких випадках до стадій бластоцисты). У інших дослідженнях було зафіксовано, що энуклеированные яйцеклітини великої рогатої худоби забезпечують реалізацію генетичного матеріалу донорських ядер з соматичних кліток людини навіть до більш просунутих ембріональних стадій. Це є свідоцтвом того, що навіть перенесення ядер в ооциты далеких в еволюційному відношенні видів забезпечує їх часткове репрограммирование. А чи може бути так, що трансплантація ядер в энуклеированные яйцеклітини близьких видів приведе до отримання повноцінного здорового потомства? В кінці 2000 - початку 2001 р. весь науковий світ стежив за спробою дослідників з американської фірми «ACT» клонувати вимираючий вид буйволів Bos gaurus (гяур), який поширений на території Індії і Південно-західної Азії. Соматичні клітки-донори ядер (шкірні фибробласты) були отримані в результаті біопсії post mortem від бика у віці 5 років і після двох пасажів в культурі тривалий час (8 років) зберігалися в криоконсервированном поляганні в рідкому азоті. Всього було отримано чотири вагітності. Щоб підтвердити генетичне походження плодів, два з них були вибірково вилучені. Цитогенетичний аналіз підтвердив наявність в клітках характерного для гяурів нормального каріотипу, проте з'ясувалося, що вся мітохондріальна ДНК походить від корів-донорів яйцеклітин (Bos taurus).

Як відомо, мітохондрії є «енергетичними станціями» кліток, саме в них відбувається синтез АТФ, з'єднання з гиперергическими зв'язками, при руйнуванні яких виділяється велика кількість енергії, використовуваної в процесах життєзабезпечення клітки. Активність мітохондрій регулюється як власним генетичним апаратом - генами, закодованими в мітохондріальній ДНК, так і генами, локалізованими в ядрі клітки. Загальна кількість мітохондріальної ДНК (мДНК) в соматичній клітці налічує 20 000-30 000 молекул на відміну від яйцеклітини ссавця, в якій міститься близько 100 000 молекул мДНК. Таке явище, коли в цитоплазмі клітки знаходиться більш за один тип мДНК, називається мітохондріальною гетероплазмией. Мітохондріальна ДНК успадковується по материнській лінії разом з цитоплазмою ооцита, тому отримувані в результаті клонування тварини не є стовідсотковими клонами, тому що несуть мітохондрії донора ядер і індивідуумів-донорів реципиентных энуклеированных яйцеклітин, і володіють, таким чином, мітохондріальною гетероплазмией. Взаємодія між ядерною ДНК і чужорідною мДНК вимагає подальшого вивчення. Мабуть, що мітохондріальна гетероплазмия може приводити до дисбалансу в енергетичному обміні клітки і служити причиною серйозних порушень. На жаль, в досвіді американських учених одна з вагітностей урвалася на 200-денному терміні, а в результаті іншої народилося теля, яке померло через 48 ч. Представниками фірми було заявлено, що це відбулося «унаслідок інфекційного клостридиозного ентерита, що не має відношення до клонування».

Робляться і інші спроби клонування з метою порятунку зникаючих видів. Так, 11 корів з ферми в штаті айова вже виношують клони немовлят бантенгов - зникаючий різновид диких азіатських биків. Китайські учені з Інституту зоологічних досліджень, що мають намір клонувати зникаючих вид гігантських панд. Їх індійські колеги збираються аналогічним чином відновити популяцію гепардів, остаточно винищених мисливцями в першій половині минулого століття, ще в часи правління Британської імперії. Донорами яйцеклітин для клонованих тварин стануть гепарди з сусіднього Ірану, що належать до того ж вигляду, що і звіри, що раніше мешкали на півострові Індостан, а сурогатними матерями, в яких розвиватимуться пересаджені яйцеклітини - самки індійського леопарда.

Клонування рослин значно простіше, ніж клонування тварин. Ми розглянемо тільки порівняно нову технологію вирощування рослин з ізольованих груп кліток і окремих соматичних кліток.

Для клонування достатньо рослинну клітку ізолювати з цілої рослини і помістити на живильне середовище, що містить сольові компоненти, вітаміни, гормони і джерело вуглеводів, вона починає ділитися і утворює культуру каллуса. Надалі каллусы можна розмножити і отримати необмежену кількість біомаси. Основна трудність, з якою відразу ж доводиться стикатися дослідникові, - це те, що клітки в штучних умовах починають бурхливо ділитися і рости, але при цьому часто не в змозі продукувати вторинні метаболиты, тобто біологічно активні речовини рослин.

Клонування рослин частіше застосовується в комплексі з іншими біотехнологічними методами, такими як злиття (гібридизація) кліток і трансгенез (міжвидове перенесення генів). Цілі рослини з реконструйованих кліток отримують потім методом клонування. Злиття кліток здійснюється декількома способами з використанням так званих фузогенных (тобто що зливають) агентів різного походження: фізичного (змінне електричне або магнітне поле), хімічного (катіони, полиэтиленгликоль і ін.), біологічного (віруси). Рослинні клітки перед злиттям перетворюють на протопласты (тобто клітки, позбавлені зовнішньої жорсткої клітинної стінки). Подальший відбір (скринінг) отриманих гібридних кліток дозволяє відібрати ті з них, які об'єднали геноми або фрагменти ДНК батьківських кліток. Клітинна інженерія дозволяє отримувати гібридні штами, клітки або навіть цілі рослини (рослини-регенерати), схрещуючи між собою филогенетически (тобто еволюційно) віддалені організми. У разі неповного злиття кліток (тобто клітка-реципієнт отримує окремі ділянки ядерного генетичного матеріалу або частини клетки- донора (органеллы)) виходять асиметричні гібриди. Це розширює можливості отримання нових сортів сільськогосподарських рослин, для створення яких раніше використовувалися методи класичної селекції.

Біологічні і етичні проблеми клонування. За останній час створені ряд міжвидових і міжродових гібридів тютюну, картоплі, томату, капусти, турнепсу, сої і ін. Використання досягнень клітинної інженерії, наприклад, дозволило розробити технології отримання безвирусных рослин (наприклад, картоплі) шляхом регенерації цілої рослини з однієї соматичної клітки.

Учені працюють над зміною генотипів злаків. Вони вводять в їх генотипи спеціальний ген бактерій, який сприятиме засвоєнню азоту з атмосферного повітря. Вирішення цієї проблеми дозволило б скоротити витрати засобів на виробництво азотних добрив.

Перенесення генів використовується і при виведенні нових сортів декоративних рослин. Так, в генотип петунії був перенесений ген, що порушує утворення пігменту в пелюстках. Таким шляхом була створена петунія з білими квітками. Завдяки методам клітинної інженерії терміни, необхідні для виведення нових сортів рослині, скорочуються з 10-12 років при використанні звичайних методів селекції до 3-4 років.

Трансгенні рослини поступово завойовують мир. Особливо інтенсивно процес йде в США, Західній Європі, Японії, Китаї. Тільки у Китаї за деякими даними зареєстровано близько 120 генетично модифікованих сортів сільськогосподарських культур. У США генетично модифікована соя витіснила традиційну. Завдяки досягненням в області трансгенеза і клонування ми зможемо вже в найближче десятиліття повною мірою скористатися рослиною як найбільш дешевою і екологічно безпечною фабрикою для виробництва більшості необхідних людині матеріалів, їжі, лікарських препаратів, хімічних сполук, сировини і так далі

Якщо говорити про перспективи медичного застосування генетично модифікованих рослин, то найбільш популярне зараз питання про синтез вітаміну А в «Золотому рисі» — продукті сумісних наукових розробок груп Інго Потрікуса з Федерального технологічного інституту (Швейцарія) і Пітера Бейера з Університету Фрайбурга (Німеччина). Отримані результати по експресії людського соматотропина (гормону зростання) в хлоропластах тютюну. Це дослідження заклало нову тенденцію в біотехнології рослин, а саме: синтез фармацевтичних і діагностичних препаратів і оральних вакцин рослинами. Експресія соматотропина тютюном — це робота Джеффрі Стауба і його колег в Monsanto Co., результати якої опубліковані в журналі Nature Biotechnology (т. 18, з. 333, 2000). Синтез рослинами антитіл і оральних вакцин вже був описаний раніше. Недоліком попередніх робіт був відносно низький рівень експресії шуканих продуктів. І ось вперше важливий з фармацевтичної точки зору білок в значних кількостях синтезований шляхом використання нової системи експресії в хлоропластах.

Біотехнологія рослин грає важливу роль і у вирішенні продовольчої проблеми. Вона дає новий могутній інструмент, доповнюючий вже існуючі способи підвищення продуктивності сільського господарства і, як наслідок, стимулювання економічного зростання в бідних країнах. Проте, тоді як медична продукція вже отримала загальне визнання, впровадження генетично модифікованих продуктів харчування в деяких розвинених країнах зустріло сильну опозицію, зв'язану, головним чином, з недоліком генетичних знань і, як наслідок, необгрунтованими страхами. Проте, певні побоювання відносно трансгенних рослин мають під собою грунт.

На думку фахівців, трансгенні організми, переважно стійкі до шкідників (в основному за рахунок токсинів, що відбуваються з Bacillus thuringiensis) здатні викликати зміни в популяції комах, проте куди більший вплив робить застосування інсектицидів. Стійкість до солей, води, засусі і інші характеристики робитимуть вплив, передбачити яке важко, тому приступати до цих розробок слід з особливою обережністю. Крім того, слід гарантувати, що будуть зроблені всі необхідні заходи обережності у всіх випадках, коли продовольчі або кормові культури модифікуються з метою отримання фармакологічно активних з'єднань, які можуть бути перенесені до інших рослин, або проникати в грунт і потім у воду. В цілому продукти селекції рослин значно менш агресивні, чим початкові або дикі рослини. Це пояснюється тим, що в них людина прагне закріпити вигідні для себе якості, а це часто серйозно обмежує їх здатність виживати за межами фермерського поля, де культивування і контроль за бур'янами значно полегшує їм життя.

Так, наприклад, багато зернових культур відбиралися за тією ознакою, що їх колоси не розсипаються в процесі дозрівання. Це істотно полегшує збирання врожаю, і в той же час перешкоджає природному розповсюдженню насіння. Ймовірно, це виявиться справедливим і відносно генетично модифікованих рослин, оскільки по своїй основі вони також є культивованими рослинами. Недавні експерименти у Великобританії показали, що сільськогосподарські генетично модифіковані рослини, що тестуються на виживання в природних умовах, не мають ніяких переваг перед їх дикими родичами.

Та все ж існують деякі побоювання, що чужорідні гени з ГМ- рослин можуть передаватися іншим диким рослинам, внаслідок чого виникнуть бур'яни, які буде складніше утримати під контролем. Ця небезпека повинна бути усвідомлена. Вважається недалекоглядним вводити ген толерантності до гербіцидів в рис там, де червоний рис виростає як бур'ян, і в сорго там, де бур'яном є гумай (алепское сорго). Схрещування з цими видами сильних бур'янів може зробити неефективним використання гербіцидів для боротьби з ними. Поки що в результаті застосування трансгенних рослин несприятливі ефекти не виявлені.

Інше застосування технології клонування - культивування рослина на живильних середовищах. Таким шляхом з невеликої частини (клітки) рослини можна отримати до 1 млн. рослин в рік. Цей метод використовують для швидкого розмноження рідкісних або знов створених цінних сортів сільськогосподарських рослин.

При культивуванні кліток рослин на живильних середовищах з однієї клітки, що багато разів ділиться, можна отримати клони, в клітках яких накопичується у декілька разів більше цінних речовин, чим у вирощуваній звичайним способом цілій рослині. Так отримують, наприклад, біомасу женьшеня для потреб парфюмерної і медичної промисловості. У 1992-93 рр. в Биолого-почвенном інституті ДВО РАН була отримана трансгенна культура жень-шеня з вбудованим геном ризогенных бактерій (rolC). Трансгенне коріння мають дуже цікаві властивості. У окремих пробах вміст гинзенозидов в них склав до 6%, що істотно перевищує вміст цих речовин в природному корінні женьшеня. Трансгенна культура кирказона маньчжурського (Aristolochia manshuriensis Кіт.) є джерелом цінного препарату кардиотропного дії, застережливої розвиток інфаркту міокарду і ефективного при інфарктній для поста реабілітації.

Одним з нових напрямів є розробка способів микроклонального розмноження рідкісних і зникаючих рослин. Отримані мікророслини в культурі in vitro женьшеня, кирказона, незабудочника, метаплексиса, гиностеммы, василистника, родиолы, кодонопсиса і інших рідкісних рослин флори. Створення такого своєрідного «банку» рослин допоможе зберегти зникаючі в природі види. У міру розробки методів відновлення природних екосистем ці банки будуть використані для реинтродукции типових рослин в природні місцепроживання.

Окремим напрямом клітинної інженерії, що має величезне практичне значення, є отримання гибридом, тобто кліток, що виникають при злитті батьківських кліток з одного організму, але з різними програмами диференціації і розвитку. Це можуть бути клітки з різних типів тканини або пухлинні клітки. Найбільший розвиток гибридомная технологія знайшла в отриманні моноклональних антитіл (МКАТ). Методика була розроблена Келлером і Мільштейном.

В цьому випадку гибридому отримують між нормальною антителобразующей кліткою і пухлинною, плазмоцитомной кліткою. Плазмоцитома була узята тому, що вона більше всього відповідала АОК за типом диференціювання. Весь її синтетичний апарат був налаштований на синтез імуноглобулінів. Проблема полягала в тому, як відокремити задану гибридому від присутніх в системі окремих кліток, що не злилися, і від гібридів іншого складу або іншої специфічності, чим потрібні.

Для досягнення цієї мети автори методики розробили спеціальну схему, що використовує відбір кліток в селектирующей середовищі. Перш за все, був отриманий особливий мутант мишачої плазмоцитоми, зростання якого можна було контролювати складом живильного середовища. Для отримання мутанта використовували особливості синтезу нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), наявних у всіх клітках і необхідних для їх існування. Відомо, що є два шляхи синтезу попередників нуклеїнових кислот: основний і резервний. Основний - це шлях новоутворення нуклеотидов, ланок, що входять до складу нуклеїнових кислот. Цей шлях включає декілька етапів і блокується протипухлинним препаратом аминоптерином (А). Проте клітки не гинуть від цього препарату, оскільки володіють резервними шляхом - здатністю синтезувати нуклеотиды і нуклеїнові кислоти, реутилизируя продукти розпаду раніше синтезованих нуклеїнових кислот: гипоксантина (Г) і тимидина (Т). Додавання Г і Т в живильне середовище, що містить А, знімає токсичний ефект останнього.

Для селекції гибридом треба було отримати мутант плазмоцитоми, не здатний користуватися резервним шляхом і, отже, що гине в середовищі, що містить Г, Т і А (ГАТ-среда). Такий мутант отримали шляхом додавання в середу токсичних аналогів Г і Т. Все клітки, здатні засвоювати Г і Т, включали їх токсичні аналоги і гинули. Виживали лише ті рідкісні мутанти, які були нездібні засвоювати Г і Т, тобто були позбавлені резервного шляху. З потомства цих кліток додатково відбирали ще і такі мутанти, які втратили здібність до синтезу власних імуноглобулінів. Тепер все було готово для отримання гибридом, тобто гібридів нормальних АОК і плазмоцитомных кліток. Мишей інтенсивно імунізували певним матеріалом - білком, бактерійною кліткою або кліткою тваринного походження. Коли в їх крові з'являлися антитіла, у них брали селезінку і лімфатичні вузли (місця скупчення АОК), і з них готували суспензію кліток. До неї додавали в надлишку клітки плазмоцитоми мутанта і полиэтиленгликоль (ПЕГ). Після короткої інкубації, потрібної для злиття кліток, їх відмивали від Пега і поміщали в середу, що містить Г, Т і А (ГАТ-среда). Тепер в системі знаходилися гібриди АОК і АОК, АОК і плазмоцитоми, а також що залишилися вільними АОК і клітки плазмоцитоми. З них потрібно було відібрати тільки гібриди АОК і плазмоцитоми. Після недовгого (декілька днів) культивування одиночні АОК, а також гібриди АОК і АОК гинули, оскільки нормальні клітки смертні і швидко гинуть в культурі. Плазмоцитомниє клітки і їх гібриди також гинули, оскільки А блокував основний шлях синтезу попередників нуклеїнових кислот, а Г і Т їх не рятували. Виживали, отже, тільки гібриди АОК і плазматичних кліток, оскільки безсмертя вони успадкували від плазмоцитоми, а резервний шлях - від нормальної клітки. Такі гібриди, гибридомы, зберігали здатність синтезувати і секретировать антитіла.

Наступний етап після отримання гибридом - клонування і відбір потрібних клонів. Що вижили в ГАТ клітки розсівали в спеціальні пластикові планшети, що містять звичайні 96 лунок ємкістю приблизно по 0,2 см2. У кожну лунку поміщали в середньому по 10 гибридомных кліток, які культивували у присутності «годуючих» кліток, що не мають відношення до гибридомам, але сприяючих їх зростанню. Після декількох днів культивування вміст кожної лунки перевіряли на присутність антитіл потрібної специфічності. Для цього використовували мікрометоди виявлення антитіл до відповідного антигена. Клітки з лунок, що містять потрібні антитіла, клонували, тобто повторно розсівали по таких же лунках, але з розрахунку 1 клітка на лунку, знов культивували і перевіряли на присутність потрібних антитіл. Процедуру повторювали 1-2 рази. Таким чином, відбирали клони, що продукують антитіла тільки одній потрібної специфічності, тобто моноклональні антитіла. Отримані клони можна заморозити при – 700 З і зберігати до того, поки їх не буде потрібно. Їх можна культивувати і накопичувати антитіла в культуральному середовищі, а можна прищепити мишам (оскільки гибридомы - це пухлинні клітки), де вони будуть рости, і накопичувати колосальні кількості моноклональних антитіл. Від однієї мишки можна отримати антитіл не менше, ніж від кролика. Ці антитіла не містять сторонніх антитіл і настільки однорідні физико-хімічний, що можуть розглядатися як чисті хімічні реактиви.

Звичайні поликлональные антитіла давно і широко застосовуються для визначення біологічно активних речовин - білків крові і інших біологічних рідин, гормонів, ростових чинників, клітинних рецепторів, медіаторів запалення і імунітету, бактерійних і вірусних антигенів, різних отрут і тому подібне Моноклональні антитіла із-за високої специфічності, стандартності і технологічності отримання успішно витісняють і замінюють імунні сироватки.

Далі гибридомы створюють унікальні можливості в аналітичних цілях: їх можна застосовувати як «імунологічний мікроскоп» з надзвичайно високим дозволом. Так, наприклад, якщо потрібно порівняти дві клітинні лінії, що відрізняються одним або небагатьма антигенами, і треба виявити такі антигени, то метод гибридом надає для цього виняткові можливості. Проїммунізіровав мишей однієї з ліній і отримавши сотні гибридом, що продукують антитіла до антигенів цієї лінії, можна знайти одну або дві з антитілами тільки до даної лінії. Розмноживши таку гибридому в пробірці або виростивши її на мишах, можна отримати величезну кількість антитіл до унікального антигена (або детерминантной групі), загубленого серед інших компонентів клітки подібно до голки в стозі сіна. Це буде продукт одного клона. У крові імунізованої тварини серед безлічі інших антитіл він ніяк не виявиться із-за чисто кількісних відносин. Завдяки гибридомам його можна не тільки виявити, але і вивести в лінію і отримати будь-яку кількість відповідних антитіл. За допомогою гибридом можна виявити антигени, характерні для пухлин певних тканин, отримати до них антитіла і використовувати їх для діагностики і типирования пухлин. Такі моноклональні антитіла знайшли широке застосування в онкологічній клініці. Нарешті, у всьому світі ведуться активні дослідження по використанню моноклональних антитіл як специфічні переносники токсичних речовин в пухлинні клітки. Поки ж за допомогою моноклональних антитіл в пухлину і її метастази доставляються радіоактивні речовини, пухлини, що дозволяють виявити невеликі вузлики, по локалізації в них радіоактивності.

Гибрідоми зіграли і продовжують грати величезну роль у фундаментальній і прикладній імунології. Вони створені на основі клонально-селекционной теорії імунітету і з'явилися найяскравішим і остаточним доказом цієї теорії. Гибрідоми зробили реальністю передбачувані клони антителообразующих кліток і дозволили навіть виявити їх існування в організмі до введення відповідного антигена.

Гибрідоми революціонізували імунологічну промисловість і створили в ній абсолютно нові області. Завдяки гибридомам виникли нові методи діагностики багатьох захворювань і відкрилися нові шляхи для вивчення злоякісних пухлин. І хоча гибридомы швидше відносяться до винаходів, а не до відкриттів, вони були відмічені в 1984 році Нобелівською премією, вищою науковою нагородою, що присуджується за видатні відкриття. Особливо слід зазначити безкорисливість авторів. Якби Келер і Мільштейн запатентували свій метод, вони незабаром би стали мільярдерами, оскільки всі, хто використовував би гибридомы в комерційних цілях, повинно було б платити за право користуватися патентом. Автори гибридом, поза сумнівом, розуміли це, але на користь розвитку науки не пішли на такий крок. Метод гибридом безперешкодно увійшов до всіх сфер імунології, і самі автори всемірно сприяли цьому, надаючи свою клітинну лінію плазмоцитоми для досліджень всім охочим. І перші гибридомы в наший країні, отримані в 1979-1980 роках, були створені на основі кліток, ведучих походження з лабораторії цих авторів і з їх дозволу.

Як наголошувалося, клітки тварин, диференціюючись, позбавляються тотипотентности, і в цьому - одна з істотних їх відмінностей від кліток рослин. Саме тут головна перешкода для клонування дорослих хребетних тварин. Методи клонування цілих тварин до цих пір не доведені до стадії практичного («промислового») застосування.

Найбільш вдалими є експерименти по клонуванню тварин з ембріональних недиференційованих кліток, тотипотентных властивостей, що не втратили, проте є позитивні результати і із зрілими клітками. Процес клонування протікає таким чином - ядро соматичної клітки пересаджують в позбавлену ядра (энуклеированную) яйцеклітину і імплантують її в організм матери (якщо це тварина, що вимагає виношування).

Енуклеация традиційно проводиться микрохирургически або шляхом руйнування ядра ультрафиолетом, пересадка проводиться за допомогою тонкої скляної піпетки або електрозлиттям. Останнім часом учені з данського Інституту сільськогосподарських наук розробили недорогу технологію клонування, яка набагато простіше використовуваною нині. За новою технологією, яйцеклітини розрізають навпіл, і половинки з ядрами викидаються. Вибирається пара порожніх половинок, що залишилися, які «склеюються» в одну яйцеклітину після додавання нового ядра. Найдорожча частина устаткування, яку використовували в цьому експерименті, — машина для «зварки» кліток — коштує всього лише $3,5 тисяч. Технологія може бути повністю автоматизована і поставлена «на потік».

Успішність пересадки залежить від виду тварини (амфібій клонують успішніше, ніж ссавцям), методики пересадки і ступеня диференціювання клітки-донора. Так, ще Бріггс і Кинг в перших дослідах на амфібіях встановили, що якщо брати ядра з кліток зародка на ранній стадії його розвитку бластуле, то приблизно в 80% випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється на нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, просунувся на наступну стадію - гаструлу, то лише менш ніж в 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результати пізніше були підтверджені і в інших роботах.

Гердон (див. вищий), що використав як донорів спеціалізовані клітки епітелію, отримав наступні результати: в більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина їх їх утворювала ембріони. 6,5% з цих ембріонів досягали стадії бластулы, 2,5% - стадії пуголовка і лише 1% розвинувся в статевозрілі особини. Проте поява декількох дорослих особин в таких умовах могла бути пов'язане з тим, що серед кліток епітелію кишечника пуголовка, що розвивається, досить тривалий час присутні первинні статеві клітки, ядра яких могли бути використані для пересадки. У подальших роботах, як сам автор, так і багато інших дослідників не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин (з ядром клітки кишкового епітелію) гинуть до завершення стадії гаструлы, він спробував витягувати з них ядра на стадії бластулы і знову пересадити їх в нові энуклеированные яйцеклітини (така процедура називається «Серійною пересадкою» на відміну від «первинної пересадки»). Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшувалося, і вони розвивалися до пізніших стадій в порівнянні із зародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер. Таким чином, в багатьох роботах показано, що у разі амфібій донорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку, хоча і клони диференційованих кліток вдавалося «доводити» до пізніх стадій, особливо при використанні методу серійних пересадок.

Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів кліток одного і того ж організму генетично ідентичні і в процесі клітинного диференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, проте серійні пересадки ядер і культивування кліток in vitro якоюсь мірою збільшує цю здатність.

У ссавців як донори використовуються малодиференційовані стволові клітини або клітки ранніх ембріонів. Робота методично виявилася досить важкою, перш за все тому, що об'єм яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у амфібій. Проте ці труднощі були успішно подолані. Експериментатори навчилися микрохирургически видаляти пронуклеусы із зигот (запліднених яйцеклітин) ссавців і пересаджувати в них клітинні. Досліди на мишах закінчилися повною невдачею - клони гинули на стадії бластоцисты, що зв'язане, очевидно, з дуже ранньою активацією генома зародка - вже на стадії 2-х кліток. У інших ссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в эмбриогенезе відбувається пізніше, на 8-16-клітинній стадії. Можливо, тому перші значні успіхи в клонуванні ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Для кроликів (Стік і Робл, 1989) був отриманий результат - 3,7% реконструйованих яйцеклітин розвинулися до нормальних тварин.

Робота з реконструйованими яйцеклітинами крупних домашніх тварин, корів або овець, йде декілька по-іншому. Їх спочатку культивують не in vitro, а in vivo - в перев'язаному яйцепроводі вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта — корови або вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до народження дитинчати. За даними одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітині, чим в культуральному середовищі, хоча деякі дослідники отримали непогані результати і при культивуванні.

Таким чином, була в цілому вирішена проблема клонування великої рогатої худоби. Наприклад, в одному з експериментів, 92 яйцеклітини з 463 розвинулися до дорослих корів.

Пізніше були отримані клони овець, що розглянуте раніше. Велике значення мав той факт, що автори, враховуючи результати своїх попередніх робіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнтів і кліток донорів. З інших ссавців були успішно клоновані свині.

З викладеного вище витікає, що методично або технічно клонування дорослих ссавців розроблене ще недостатньо для практичного застосування. Для цього необхідно розширити круг досліджень, включивши в нього, окрім овець, представників і інших видів тварин. Такі роботи необхідні, щоб встановити, чи не обмежується можливість клонування дорослих ссавців особливостями або специфікою якого-небудь одного або декількох видів.

Потім необхідно істотно підвищити вихід життєздатних реконструйованих ембріонів і дорослих клонованих тварин, з'ясувати, чи не впливають методичні прийоми на тривалість життя, функціональні характеристики і плодючість тварин. Для клонів високий ризик дефектного розвитку реконструйованої яйцеклітини, головною причиною якого може бути неповне репрограммирование генома донорського ядра.

Що ж до можливості клонування людини, яка викликала бурхливу реакцію суспільства, то про неї говорити поки не доводитися. Перспективним напрямом в технології клонування тварин є вивчення генетичних механізмів розвитку і диференціювання кліток. Так, Рудольф Яніш з Whitehead Institute виявив, що 70-80 генів, які зазвичай активізуються в мишачих ембріонах, що розвиваються, у клонів виявляються або неактивні, або демонструють знижену активність. Хоча незрозуміло, що ж роблять ці гени, однозначно встановлено, що вони включаються одночасно з ще одним геном, Oct4. Цей ген, у свою чергу, дає ембріонам можливість створювати плюрипотентные клітки - тобто клітки, які можуть перетворитися на будь-яку тканину. Можливо, що частина генів, що активізуються одночасно з цим, також задіюється в цьому процесі. Тепер ученим належить з'ясувати, що примушує ці гени мовчати. У разі успіху наука зробить важливий крок вперед в розробці методології клонування.

Великі перспективи бачать вчені в поєднанні клонування і трансгенеза. Трансгенез - це техніка перенесення екзогенної ДНК, тобто генів, через клітки зародка в цілий новий організм. Експлуатуючи цей метод, можна отримувати тварин, що несуть якісно нові ознаки. Наприклад, можливе створення порід, що стійких до захворювань або несуть нові, корисні для промислової діяльності людини ознаки. З розповсюдженням трансгенеза процес створення нових порід і ліній продуктивних тварин значно прискориться. Крім того, цей метод дозволяє вже в даний час перенести дослідження функціональної активності генів in vitro (на культурах кліток) в умови in vivo (на живих організмах), що важливе для розуміння фундаментальних основ життя. На думку багатьох видних учених, технологія створення трансгенних тварин - це одна з найбільш захоплюючих галузей науки, що з'явилися в останні два десятиліття.

Виробництво людських рекомбинантных медичних препаратів з молока трансгенних тварин служить виходом з багатьох утруднень, пов'язаних з мікробними біореакторами, таких як відсутність у бактерій трансляцій поста модифікацій білків, неправильне складання молекул речовини, що синтезується, високі витрати на очищення. Використання клітинних культур тварин як біореактори характеризується високими витратами на культуральні середовища і невисоким виходом продукту. Тому багато фахівців в області клонування бачать головне завдання в застосуванні технології перенесення ядер для створення і розмноження трансгенних тварин з корисними властивостями.

В даний час існують різні технології створення трансгенних тварин. Найбільш поширена - це мікроін'єкції генних конструкцій в пронуклеусы зигот ссавців. Серйозною перешкодою на шляху використання цього методу є низька ефективність його застосування у сільськогосподарських видів тварин (<1%). Техніка перенесення ядер може допомогти в рішенні і цієї проблеми.

Створення трансгенних тварин методом клонування, як правило, починається з отримання культури кліток-донорів ядер. У 1997 р. І. Уїлмут, К. Кемпбелл і ін. виділили культуру овечих фетальных фибробластов з плодів на 35-денному терміні суягности. На другому етапі фибробласты трансфицировались екзогенної ДНК: двома генними конструкціями, одна з яких несла ген 9-го чинника згортання крові (ген інтересу) під бета-глобулиновым промотором, що викликає експресію в молочній залозі овець, а інша - ген стійкості до антибіотика неоміцину (маркерний), який дозволив відібрати трансфицированные клони, а вони надалі піддавалися аналізу на зміст потрібного гена. Перенесення ядер трансфектантов в энуклеированные ооциты відбувалося по методиці, використаній при клонуванні Доллі. У результаті було отримано трьох трансгенних ягнят, що несуть обидва гени: маркерний і ген інтересу. Білок 9-й чинник згортання крові грає важливу роль в коагуляції крові, його недолік викликає гемофілію Ст.

В даний час він проводиться з людської сироватки, тому вироблення цього білка з молока овець могло б стати альтернативним джерелом, позбавленим потенційній можливості перенесення інфекційних захворювань. Це було перше повідомлення про народження трансгенних тварин в результаті застосування технології клонування. Вже відомо про отримання з використанням методу перенесення ядер трансгенних мишей, великої рогатої худоби, овець і кіз. Як донори ядер використовувалися як трансфицированные культури ембріональних фибробластов, так і ембріональних стволових клітин.

Клонування цінних трансгенних тварин може швидко і економічно забезпечити людство новими лікарськими препаратами, що містяться в молоці, спеціально отриманих для цього генноинженерными методами овець, кіз або корів. З'явилося повідомлення, що ученим з шотландської фірми PPL Therapeutics, того самого, де була клонована Доллі, вдалося отримати успішні клони овечок із зміненою ДНК. Був упроваджений ген, який додає в молоко овець фермент, використовуваний в сучасній фармакології для лікування спадкової емфіземи легенів. При створенні Доллі статевий процес був «обійдений», що дозволило виключити гени, що випадково набували при схрещуванні, і відкрити дорогу «чистому» генетичному програмуванню. Наступним кроком шотландських учених стало виведення клонованих овець, які мають спеціальний ген, що дозволяє їм проводити молоко з такими ж білками, як у людини. За словами директора фірми PPL Therapeutics Алана Колмена, «значення подібної методики полягає в тому, що тепер ми можемо вибирати ще до народження гени, які хочемо змінити або видалити». А це вже означало принципову можливість вирощувати для трансплантації людські тканини і органи усередині, наприклад, свиней, найбільш близьких нам по ряду важливих біологічних параметрів.

Не дивлячись на масовий ажіотаж з приводу досягнень в області клонування і численні спекуляції в пресі і на телебаченні в недавньому минулому, зважаючи на останні відкриття в цій області, виникає більше питань, чим відповідей на них. В даний час сама можливість отримання стабільних клонів ставиться під сумнів. Епігенетічеськая модифікація генома забезпечує активацію певних генів в різні періоди розвитку і включає метилирование ДНК, специфічне з'єднання гистонов в нуклеосомы і ремоделирование інших хроматинассоциированных протеїнів. Обидва батьківські геноми формуються протягом гаметогенеза так, щоб відповідати складу цитоплазми яйцеклітини і направляти розвиток всього організму.

Щоб успішно реалізувати генетичну інформацію, ядро соматичної клітки після трансплантації винне швидко репрограммироваться для експресії генів, що включаються на ранніх етапах розвитку. У 80-х роках Д. Солтер і інші дослідники встановили, що батьківський і материнський геноми функціонально неідентичні і обидва необхідні для нормального розвитку. Таке явище називається імпринтінгом генома (див. 1.3). Воно полягає в тому, що з двох аллелей одного гена в гомологичных хромосомах після запліднення може бути функціональне активним тільки батьківський або тільки материнський.

Нормальний розвиток вимагає правильної експресії импринтированных генів. У клонованих тварин із-за неповного репрограммирования ядра соматичної клітки і порушення експресії импринтированных генів виникає эпигенетическая нестабільність генома. Невідповідний даному гену рівень метилирования змінює його активність і може приводити до його повної инактивации або навпаки - до його активування. Більшість процесів в організмі знаходяться під подвійним, потрійним і так далі контролем з боку генетичного апарату клітки, завдяки цьому в результаті трансплантації ядер відносно часто народжується і зростає повноцінний молодняк. Дослідникам не вдалося ідентифікувати гени, порушення регуляції яких приводило б до патології плаценти, що часто зустрічається, і аномальної ваги у клонованих мишей. Можливо, що це результат кумулятивної дії багато неправильно экспрессирующихся генів. Висувається гіпотеза, що розвиток ссавців швидше толерантно до эпигенетической нестабільності і летальний ефект виявляється тільки при втратах нормальної регуляції в множинних локусах. Зовні здорові клоновані тварини можуть мати різні фізіологічні порушення, які важко виявити.

До цих пір невідомо, чому не вдається розмножити послідовним клонуванням мишей далі 6-го покоління. Це може бути пов'язано з накопиченням в поколіннях мутацій в соматичних клітках або з укороченням в кожному раунді реплікації кінцевих ділянок хромосом – теломер (див. 1.2). Процес реплікації ДНК при діленні клітин відбувається таким чином, що теломеры протягом життя людини або тварини коротшають. Існує фермент теломераза, який добудовує кінцеві ділянки хромосом, проте високою теломеразной активністю володіють тільки тотипотентные клітки на ранніх стадіях ембріонального розвитку в період підвищеної кількості митозов і термінальні, які дають початок гаметам.

Теломераза посилено синтезується також в пухлинних клітках, що характеризуються здібністю до необмеженого ділення. З укороченням кінцевих ділянок хромосом зв'язують в даний час процеси старіння організму людини: коли теломеры досягають певної довжини, подальше ділення клітин стає неможливим, і тканини втрачають свою активність регенерації і функціональної. Оскільки при трансплантації ядер донором служать соматичні клітки, не экспрессирующие теломеразу, для встановлення генетичного віку клонального тварини визначається статус теломер в його клітках. Саме таким чином було показано, що перша клонована з соматичних кліток вівця Доллі генетично старше за своїх ровесників. Укорочення теломер у клонів надалі не підтвердилося в дослідах на великій рогатій худобі. Як виявилось, теломеразная активність наново виникає в клонованих ембріонах і відбувається відновлення кінців хромосом до нормальної довжини.

Клонування ссавців це одна із захоплюючих проблем сучасної біології, проте, спроби створення клонів не можна назвати успішними. Велика частина реконструйованих зародків не розвивається далі ранніх ембріональних стадій, з тих, що народилися близько половини не досягає дорослого стану, і немає упевненості в тому, що дорослі клони - абсолютно здорові тварини. Вивчення фундаментальних основ генної експресії і генетичного контролю розвитку допоможе пояснити причини утруднень, з якими стикається новий напрям. Технологія клонування вже внесла величезний внесок до нашого розуміння ранніх процесів розвитку, взаємодій батьківських геномів, репрограммирования ядер і імпринтінгу генома. Було б короткозорістю відкинути метод трансплантації ядер, поки ми в точності не дізнаємося всі можливі перспективи його використання.

Клонування людини: етичні проблеми. Принципова можливість клонування людини викликала бурхливе обговорення у всьому світі. З одного боку з'явилися гарячі поклонники клонування (аж до створення релігійних сект), що бачать в нім можливість поліпшення людської природи, досягнення безсмертя або, принаймні, радикальний метод боротьби з хворобами. З іншого боку, ще численніші голоси рішучих супротивників всяких спроб клонування людини. Традиційно консервативну позицію, займають, зокрема, представники провідних релігій.

Багато в чому, спори навколо проблеми пов'язані з поширеною в суспільстві генетичною неписьменністю. Опити, проведені в США, показали, що значне число американців боїться створення «армій клонів», «виведення суперраси». Є люди, які щиро вважають, що за допомогою клонування можна в буквальному розумінні відродити померлих людей і так далі Але навіть якщо залишити осторонь явні помилки, а також апеляції до релігійних відчуттів, які розділяють далеко не все, все одно залишаються реальні етичні проблеми. Репродуктивне клонування викликає наступні заперечення: украй низька результативність клонування, висока летальність серед клонів роблять спроби клонування людини етично неприйнятними, аж до удосконалення методики до прийнятного рівня безпеки для клона.

Невідомо, як впливатиме на розвиток людини і структуру суспільства новий тип сімейних відносин, який може скластися у зв'язку з розповсюдженням клонування.

Припускають, що клони матимуть проблеми із становленням особової самосвідомості, з інтеграцією в людське суспільство.

Клонування обмежує генетична різноманітність людини. Терапевтичне клонування викликає питання у зв'язку з технологією його проведення. В даний час реально осуществима тільки технологія клонування, що припускає вирощування клона до певної межі in vivo. Природно, до людини це не застосовно - жінка не може розглядатися як інкубатор терапевтичного матеріалу. Ця проблема вирішується розробкою устаткування для вирощування зародка in vitro. Проте, залишається проблема «вбивства» зародка. З яких пір зародок стає людиною? Існує думка, що нова людина виникає у момент зачаття (у разі клона - у момент пересадки ядра). В цьому випадку використання зародка для вирощування трансплантатів неприпустимо. На це заперечують, що до певного періоду зародок представляє лише скупчення кліток, але ніяк не людську особу. Для подолання цієї проблеми учені намагаються почати роботу із зародком якомога раніше. Констатуємо, що відношення суспільства до репродуктивного клонування в цілому негативне. У всіх країнах, де вже розроблено законодавство по клонуванню, репродуктивне клонування заборонене. Проте залишається немало держав, не регулюючі питання клонування, чим і користуються наукові авантюристи, що намагаються (або що вдають, що намагаються) клонувати людину.

До терапевтичного клонування відношення м'якше, що, мабуть, викликано його більшою цінністю. Якщо важко представити практичне застосування репродуктивного клонування (хіба, що випадки безпліддя з неможливістю штучного запліднення), то значення терапевтичного клонування, поза сумнівом. Так, у Великобританії терапевтичне клонування офіційно дозволене. При цьому жорстко обмежується вік ембріона, з яким можна вести роботу (у Британії - не більше 10 тижнів).

Терапевтичне клонування і його перспективи в медицині. Термін «терапевтичне клонування» означає метод отримання клітинних культур- трансплантатів, який полягає в тому, що ядро соматичної клітки пацієнта (наприклад, шкірних фибробластов) переноситься в энуклеированный донорський ооцит. Після процесу репрограммирования це ядро стає тотипотентным і ініціює формування ембріона, який на певній стадії розвитку може використовуватися для отримання культури ембріональних стволових клітин (ЕС клітки), що володіють ядерним геномом пацієнта. Культура ЕС кліток піддається дії веществ- індукторів, що викликають направлену диференціацію в певний тип кліток, наприклад, в таких як кардіоміоцити для заміщення пошкодженої ділянки міокарду або в тих, що синтезують інсулін бета-клетки острівців Лангерганса. В даний час розробляються інші методи отримання ЕС клітинних культур з використанням технології генетичної модифікації генома для відбору диференційованих популяцій.

Успішно проведені експерименти по клонуванню макак-резус американськими ученими Л. Менг і ін. з центру по вивченню приматів в орегоні свідчать про потенційну можливість перенесення технології трансплантації ядер на людину. Л. Менг і соавт. отримали два макак-резус в результаті перенесення ядер бластомеров з ранніх ембріонів. Зважаючи на значну схожість фізіології і генетики у людини і решти приматів для вивчення процесів репрограммирования генома, розвитку клонів, як під час протікання вагітності, так і в постнатальний період і їх эпигенетической стабільності нелюдські примати можуть служити найоптимальнішою моделлю.

Перш ніж стане можливим серйозно сприймати заяви про впровадження терапевтичного клонування в медицині необхідно добитися клонування мавп з використанням соматичних диференційованих кліток. Ефективність реконструкції ембріонів приматів залежатиме від оптимізації багатьох параметрів. Наші уявлення про процеси дозрівання яйцеклітин в умовах in vitro все ще є неповними, вимагають удосконалення протоколи злиття кариопласта з цитопластом і активаціями генома. Електрозлиття не вважається в даний час найбільш ефективним методом для з'єднання донорського ядра з энуклеированной яйцеклітиною: електричний імпульс викликає одночасно активацію реконструйованого ооцита, унаслідок чого в ядрі не встигають завершитися процеси репрограммирования ядра. Вже розроблені методики по індукції злиття з використанням фитогемагглютинина, этиленгликоля і мікрохірургічними методами, які не викликають одночасну активацію. Це дозволяє відстрочити її індукцію у прооперованого ооцита на 4-5 ч.

Згідно вищезазначеній методиці І. Тезарік, П. Наги і ін. в 2000 р. переносили кариопласты зрілих людських ооцитов в інших энуклеированные ооциты на стадії метафази П. Ученимі вивчалися злиття кариопласта з цитопластом і спонтанною і хімічною активацією реконструйованої яйцеклітини. Ця технологія, на думку дослідників, може знайти застосування при лікуванні безпліддя, пов'язаного з недостатністю функції компонентів цитоплазми яйцеклітин. До подібних експериментів необхідно відноситися з великою обережністю, оскільки сама методика механічного перенесення кариопласта, дію на яйцеклітину хімічних агентів злиття можуть мати непередбачувані наслідки.

Навіть упроваджувана технологія перенесення незначної кількості цитоплазми від ооцита здорового донора в реципиентную яйцеклітину пацієнта в даний час піддається активній критиці із-за можливої дисрегуляции у взаєминах між ДНК ядра і мітохондрій. Негативний ефект генетичного химеризма може бути ще сильнішим при тотальній заміні оточення цитоплазми кариопласта і виявитися у вигляді порушень різної природи як у внутріутробний період розвитку, так і після народження організму.

Новітні технології в області клонування і створення ембріональних стволових клітин відкривають величезні можливості для лікування багатьох захворювань, пов'язаних з дегенерацією певних типів кліток, втратою функцій тканин і цілих органів. Близько 16 млн. чоловік у всьому світі страждають нейродегенеративными захворюваннями, такими як хвороба Альцгеймера і Паркінсона, понад 120 млн. - діабетом і мільйони - артритами, СНІДОМ, інфарктами і іншими захворюваннями, які можуть бути вилікувані за допомогою застосування клітинних трансплантатів.

По найскромніших підрахунках десятки найбільш поширених захворювань можуть бути вилікувані з впровадженням клітинної терапії. Методи терапевтичного клонування дозволяють уникнути імунного відторгнення трансплантатів, оскільки ЕС клітки несуть генетичну інформацію донора ядер. Низька ефективність трансплантації ядер не важлива для здійснення клітинної терапії, оскільки для отримання лінії ЕС кліток досить всього одного або декілька ембріонів передімплантацій. Крім того, зараз розглядається питання про використання як цитопластов энуклеированных яйцеклітин тварин, наприклад, великої рогатої худоби, які підтримують реалізацію генетичного матеріалу ядра людської соматичної клітки до стадії 5-денного ембріона.

Однією з перспективних сфер застосування клонування може опинитися ксенотрансплантація, тобто міжвидова трансплантація тканин і органів.

Деякими компаніями ведеться робота із створення лінії свиней з інактивованим геном альфа-1,3-галактозилтрансферазы. Цей ген кодує фермент, що бере участь в синтезі поверхневих антигенів кліток свиней, які обумовлюють негайне відторгнення трансплантатів у приматів. Технологія клонування з використанням генетично модифікованих культур кліток як донори ядер значно спростить процес створення такої лінії.

Важливий результат отриманий американськими ученими, яким вдалося розробити метод вирощування нових кісток в хребті щурів. У проведених експериментах учені працювали із стволовими клітинами. Вони модифікували їх так, що стволові клітини кісткового мозку сталі экспрессировать білок ВМР-9, який сприяє зростанню нових кісток. Потім модифіковані клітки були ін'єктовані в один бік хребта щурів, тоді як в іншу учені ін'єктували стволові клітини, що містять інактивований ген. Через 8 тижнів після початку експерименту було зафіксовано зростання кісток лише на тій стороні спини, яка містила модифіковані стволові клітини. При цьому знов освічені кістки виглядали абсолютно нормально. Ця методика поки не була випробувана на людях, проте дослідники вважають, що цей метод генної терапії, який включає етап роботи з клітками поза організмом, є багатообіцяючим для лікування захворювань кісток, а також показником перспективності терапевтичного клонування взагалі.

Не менш цікаві результати отримали російські учені. Їм вдалося клонувати із стволових клітин людини кардіоміоцити.

Гематологічне клонування. На певній стадії розвитку ембріон складається з абсолютно однакових стволових клітин. Пізніше вони стануть диференційованими і відповідатимуть за розвиток різних органів. Після народження стволові клітини продовжують залишатися в організмі, забезпечуючи оновлення старіючих кліток, але з віком вони по тих або інших причинах кінчаються або гинуть. Клітки перестають оновлюватися, що украй згубно впливає на здоров'ї людини і імовірно є причиною старіння організму. Якби стволові клітини не гинули, можливо (це слід підкреслити) організм не був би схильний до старіння взагалі або цей процес проходив би не так швидко. Гематологічне клонування направлене на заповнення втрачених стволових клітин, наявність яких повинна відтягнути смерть пацієнта на якомога довший термін. Також воно може бути використане для відновлення пошкоджених органів.

Сам процес виглядає таким чином: з будь-якої клітки пацієнта витягується ядро, яке потім поміщається в яйцеклітину. Починається розвиток. Після закінчення чотирьох діб зародок представляє крихітну бульбашку (бластоциста) заповнений стволовими плюрипотентными (недиференційованими) клітинами. Коли, у міру розвитку стволові клітини стали мультипотентными (диференційованими) і їх кількість достатньо велике, їх можна витягувати і ввести пацієнтові. Найважче, що потрібно зробити - це підштовхнути плюрипотентные клітки до розвитку в потрібному напрямі.

Важливі результати в цій області були отримані в США. Згідно з попередніми результатами, американські учені знаходяться на завершальному етапі розробки технології, яка дозволить відновлювати пошкоджені віком або хворобою органи за допомогою клонованих кліток цього ж організму.

Дослідники компанії Advanced Cell Technology (штат Массачусетс, США) клонували клітки покривних тканин двох корів, після чого стволові клітини крові, отримані з клонованих ембріонів, імплантувалися початковим тваринам. При цьому імунна система однієї з корів пригнічувалася імунодепресантами. Згідно з отриманими результатами, колонією кров'яних кліток, подіями з клонів, проявляли дивовижні замісні здібності: зокрема, навіть у тварини з нормально функціонуючою імунною системою, вони незабаром складали до 50% всієї клітинної популяції. Механізм «омолоджування» кліток не вивчений. Висуваються версії щодо того, що дане явище пов'язане із зміною стану кінцевих ділянок хромосом, так званих теломеров (див. 1.2).

У випадку якщо нова методика зарекомендує себе як ефективна і безпечна, її можна буде використовувати для замісної терапії хворих лейкемією, а також автоімунними захворюваннями, зокрема, артритом. Крім того, наголошується, що клоновані стволові клітини крові можуть сприяти відновленню широкого круга інших органів. Ймовірно, такі регенеративні властивості пов'язані з тим, що «омолоджені» кров'яні клітки інтенсивніше знищують старі і дефектні клітки і структури органів, тим самим, сприяючи їх оновленню.

Проте до того як описана методика зможе бути застосована в клініці, слід провести ще великий об'єм досліджень. Зокрема, зараз необхідно з'ясувати, чи не можуть клоновані клітки набувати злоякісних властивостей. Слід також відзначити, що у випадку з коровами, що використалися в дослідах массачусетськими дослідниками, стволові клітини витягувалися з 100-денних ембріонів, що у жодному випадку не допустимо відносно людини. Зараз учені вирішують питання отримання стволових клітин на максимально ранніх етапах розвитку зародка.