4.2.10. Разработка методов микробиологических исследований
Развитие научных представлений о микроорганизмах сопровождалось созданием новых принципов и методов микробиологических исследований.
Первые практические указания о способах культивирования микробов и защиты от внесения посторонней микрофлоры появились в ходе изучения проблемы самозарождения. Это – стерилизация питательных сред путем кипячения, применение асбестовых и ватных пробок для закупоривания сосудов, способы химической и термической очистки вводимого в сосуды воздуха и т.д. Наиболее значительными в этом отношении были работы английского физика Д. Тиндаля (рис. 4.2.26), предложившего метод определения степени насыщенности воздуха микроорганизмами. Разрабатывая этот метод, Тиндаль опирался на работы Пастера.
Рис. 4.2.26. Джон Тиндаль (John Tyndall, 1820-1893)
В основе методов Тиндаля лежала способность мельчайших частиц и пылинок рассеивать луч света, который благодаря этому становится видимым – явление, получившее название «эффект Тиндаля» (рис. 4.2.27). В 1869 г. он показал, что воздух становится «оптически пустым», т.е. стерильным, при его фильтровании через плотную ватную пробку. Он не вызывает загнивания питательных сред. В 1877 г. Тиндаль обнаружил, что терморезистентность одного и того же вида микробов изменяется в зависимости от стадии его развития. Исходя из этого положения, Тиндаль разработал метод фракционной стерилизации сред, заключающийся в их периодическом прогревании. Этот метод, названный тиндализацией, нашел затем широкое применение в микробиологии.
Рис. 4.2.27. Эффект Тиндаля
Значительное совершенствование методов микробиологических исследований произошло в ходе изучения этиологии инфекционных болезней. Попытки определения специфических возбудителей и изучения их особенностей способствовали созданию разнообразных методов культивирования микробов, среди которых наиболее важными оказались методы выделения чистых культур. Впервые на принципиальную возможность выделения болезнетворных микробов и «инфузорий» в чистые культуры указал в 1840 г. Я. Генле.
В 1876 г. К. Виттандини, а вслед за ним Э.Клебс и О.Брефельд разработали метод использования желатины в качестве плотной питательной среды. Этот метод наряду с методом выращивания микробов на агар-агаре, который в 1883 г. ввела в практику А. Хессе, положил начало широкому применению плотных прозрачных естественных питательных сред для культивирования микробов. Изготовление жидких питательных сред, сначала синтетических, было начато в 1858 г. Пастером в его исследованиях молочнокислого брожения. Изобретение методов стерилизации открыло возможность использования жидких естественных питательных сред. Изготовление Пастером мясного бульона с добавлением в него пептона (МПБ) положило начало широкому применению жидких культуральных сред. Оно послужило основой для создания (Л. Пастер) и дальнейшего совершенствования (Э. Клебс, Г. Галлир, Дж. Листер) метода разведения, широко вошедшего в практику выделения чистых культур.
Наиболее ценный вклад в развитие техники микробиологических исследований внесли Р. Кох и его школа. В 1882 г. Кох соединил преимущества непрозрачных плотных сред (пространственное расположение колоний) и прозрачных жидких сред в едином методе плотных прозрачных сред. Введением этого метода был создан простейший способ получения чистых культур микробов. Изготовление других плотных сред по принципу Коха — МПЖ (мясопептонная желатина) и МПА (мясопентонный агар) в совокупности с изобретением Г. Гаффки и Ф. Лефлера — культивирование микробов на предметном стекле (или в чашках Петри) — имело огромное значение для всего развития микробиологии.
Столь же перспективным оказался и созданный в 1887- 4890 гг. С. Н. Виноградским метод элективных культур и метод обогатительных культур Бейеринка (1890). Для выделения в лабораторных условиях группы бактерий с определенными свойствами русский микробиолог С.Н. Виноградский (1856—1953) предложил создавать специфические (элективные) условия, дающие возможность преимущественного развития данной группы организмов. С.Н. Виноградский предположил, что среди микроорганизмов есть виды, способные усваивать молекулярный азот атмосферы, являющийся инертной формой азота по отношению ко всем животным и растениям. Для выделения таких микроорганизмов в питательную среду были внесены источники углерода, фосфора и другие минеральные соли, но не добавлено никаких соединений, содержащих азот. В результате в этих условиях не могли расти микроорганизмы, которым необходим азот в форме органических или неорганических соединений, но могли расти виды, обладавшие способностью фиксировать азот атмосферы. Именно так С. Н. Виноградским в 1893 г. был выделен из почвы анаэробный азотфиксатор, названный им в честь Л. Пастера Clostridium pasteurianum.
Большое значение для прогресса микробиологии имела также разработка методов окрашивания и фиксации микробов. Они совершенствовались параллельно с развитием этих методов в гистологии, цитохимии т.д. Так, способ избирательного обесцвечивания окрашенных тканей спиртом, введенный в 1869 г. гистологом А. Беттчером, нашел широкое применение и в микробиологии. Дифференцированное окрашивание различных форм микробов стало применяться после исследований К. Вейгерта, которому в 1871 г. удалось окрасить кокковидные зооглеи аммиачным кармином, а также с работ Эберта, который в 1872 г. окрашивал кокки гематоксилином. В 1875 г. Вейгерт впервые разработал метод окрашивания бактерий анилиновыми красками. С тех пор этот метод широко применяется в микробиологии.
На основе учета избирательной восприимчивости микробов к основным анилиновым краскам и невосприимчивости к кислым анилиновым краскам П. Эрлих предложил в 1886 г. использовать феномен окрашивания не только для их дифференцированного окрашивания, но и в качестве реактива на самое присутствие микробов.
Принципиальное значение получил метод окрашивания микробов, разработанный в 1884 г. Г. Грамом (рис. 4.2.28). Сущность его состояла в выделении промежуточного состояния окрашивания между максимальным окрашиванием (генцианвиолетом) и обесцвечиванием препарата под действием сначала йода (раствор люголя), а затем спирта с последующей дополнительной окраской (везувином). Микробы, воспринимающие дополнительное окрашивание, стали считаться грамотрицательными, неокрашивающиеся везувином и сохраняющие первое окрашивание (генцианвиолетом) — грамположительными (рис. 4.2.29). Отношение микробов к окрашиванию по Граму является постоянным признаком и широко применяется как систематический признак.
Рис. 4.2.28. Ганс Христиан Иоахим Грам (Hans Christian Joachim Gram, 1853 - 1938)
Рис. 4.2.29. Грамположительные бактерии сибирской язвы (пурпурные палочки) в спинномозговой жидкости
Основными методами современных микробиологических исследований являются: микроскопия (световая, люминесцентная, электронная, лазерная); выделение чистых культур и контролируемое культивирование; аналитические методы (физиолого-биохимические, генетические и т.д.); молекулярно-биологические методы (в том числе обнаружение микроорганизмов без выделения в чистые культуры).