20) Як поєднати тупі (липкі) кінці

Фрагменти ДНК, у тому числі і фрагменти, що містять гени, отримують з використанням ферментів рестриктаз. Рестриктази можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і з липкими кінцями. Зшивання фрагментів ДНК проводиться трьома основними методами, що залежать від того, які кінці мають фрагменти зшиваються ДНК.

• Зшивання по однойменним "липким" кінцям (рестриктазно-лігазний метод) 1) Отримання фрагментів геномної ДНК (вставки), придатних для лігування з вектором, за допомогою рестриктаз. 2) Розрізання вектора і вставки за допомогою рестриктаз, отримання липких кінців. 3) Лігування (зшивання) фрагментів вектора і фрагментів ДНК вставки in vitro за допомогою ферменту ДНК-лігази. Для з'єднання фрагментів використовують лігази.

• Зшивання по "тупим" кінцям (конекторний метод) Тупі кінці можна добудовувати, використовуючи фермент кінцеву полінуклеотиділ-трансферазу. Вона приєднує нуклеотиди до 3'-кінців ланцюгів ДНК: до 3'-кінців одного фрагмента приєднують (А)-сегменти, а до 3'-кінців іншого фрагмента - (Т)-сегменти.

• Зшивання фрагментів с різними липкими кінцями У ситуації, коли необхідно зшити фрагменти, утворені різними ендонуклеазами рестрикції, і мають різні, тобто некомплементарні один одному липкі кінці, застосовують так звані лінкери (або "перехідники"). Лінкери - це хімічно синтезовані олігонуклеотиди, що представляють собою сайти рестрикції або їх комбінацію. При використанні лінкерів повинна враховуватися необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто в середину лінкера поміщають якийсь регуляторний генетичний елемент, наприклад, промотор або ділянка, пов'язана з рибосомою. У цьому випадку лінкери забезпечують не тільки об'єднання генів, а й зумовлюють їх експресію. Існують лінкери "тупий кінець - липкий кінець". При необхідності липкі кінці можна перетворити на тупі. Це досягається або відщепленням липких кінців з допомогою ферменту - ендонуклеази S1, яка руйнує тільки одноланцюгові ДНК, або ж липкі кінці "забудовують", тобто за допомогою ДНК-полімерази I на однониткових липких кінцях синтезують другий ланцюг.

21) Як підтвердити ефективність трансляції чужорідного генетичного матеріалу

Існують три способи конструювання, що забезпечує ефективну трансляцію.

1). Вбудовування чужорідного структурного гена без власних регулюючих елементів. Недолік: синтезується гібридний білок.

2). Створення гібридного сайту зв'язування з рібосомами – чужорідний ген несе свій ініціюючий кодон. Синтезується нормальний білок.

3). Метод гібридного оперона. Використовується принцип перекривання генів. Термінуючий кодон першого гена є часткою ініціюючого кодону іншого гена.

Забезпечення стабільності мРНК у чужорідній клітині та забезпечення стабільності чужорідного білка в клітині. Потрібно одержати мутантні ферменти, які не будуть штамувати чужорідний білок.