9) Адаптери та лінкери

Синтетичні олігонуклеотиди – лінкери та адаптери застосовують для обєднання фрагментів ДНК, які мабть кінці різної будови, і для введення спеціальних послідовностей різної будови.

Лінкери – одноланцюгові самокомплементарні олігонуклеотиди, котрі утворюють дуплекси з рівними кінцями і які містять сайти рестрикції. В лінкері може бути декілька сайтів рестрикції.

Лінкери з евним сайтом рестрикції використовують для приєднання фрагментів ДНК з рівними кінцями до ступінчатих кінців вектора, утвореного одноіменоою рестриктазою. Спочатку лінкери у вигляді дуплексів «пришивають» з обох сторін до фрагмента ДНК за допомогою ДНК-лігази ага Т4, а потім обробляють відповідною рестриктазою. Далі фрагменти+вектори об’єднують через утворені липкі кінці. Умова: фрагмент, що клонується не містить сайт розпізнавання для рестриктази.

Також лінкери використовують для обєднання молекул ДНК з рівними кінцями невизначеної будови, для утворення сайта рестрикції на стику молекул.

Адаптерами називають одно- або дволанцюгові олігонуклеотиди,призначені для обєднання молекул з несумісними кінцями. У дуплексів кінці різні: один рівний, а інший ступінчатий або обидва ступінчасті. Адаптери застосовують, коли кінці векторних і клонуємих молекул утворені різними рестриктазами, а також коли в клунуємих фрагментах ДНК є сайти рестриктаз, що використовуються.

Одноланцюгові адаптери застосовують для обєднання молекул ДНК з 5’ і 3’ виступаючими кінцями. Якщо після цього виникають певні пробіли в дволанцюговій структурі ДНК, їх заповнюють нуклеотидними залишками in vivo після трансформації.

В готовому вигляді є лише одноланцюгові лінкери та адаптери. Дволанцюгові адаптери за необхідності отримують комбінацією двох одноланцюгових адапторів, двох лінкерів або лінкера та адаптера.

Дволанцюгові адаптери з різними виступаючими кінцями здатні змінювати виступаючі кінці ДНК. Такі адаптери – конверсійні.

10) Методи введення днк в клітину

Внесення частини генетичного матеріалу від клітини донора в клітину реципієнта називається рекомбінація. Рекомбінант має ознаки обох батьків, більша частина генів належить реципієнтові. Із ДНК двох різних батьківських клітин утвориться рекомбінантна хромосома.

У процесі рекомбінації лише частина генетичного матеріалу донора попадає в реципієнтну клітину ( частково диплоїдна клітина – мерозигота).

Екзогенот - внесений генетичний матеріал донора.

Ендогенот - генетичний матеріал реципієнтної клітини.

Механізми одержання генетичних рекомбинантів, що відрізняються:

-по походженню екзогенот;

-по розмірах екзогеноти;

-по типу нуклеїнової кислоти (дво- або одноланцюгова)

Методи генетичної інженерії in vivo:

Трансформація - обробка клітин реципієнтів молекулами ДНК, виділеними із клітин донора. Сорбування коротких молекул ДНК клітиною реципієнта.

Кон'югація - обмін генетичним матеріалом у результаті прямого схрещування бактерій клітини донора й реципієнта; проникаючий фрагмент ДНК від донора до реципієнта може бути дуже більшим, надходить одноланцюговий ланцюг.

Трансдукція - передача генетичного матеріалу за допомогою бактеріофага; передається короткий фрагмент дволанцюгової ДНК.

Механізми взаємодії:

1. Якщо екзогенота містить ділянки, гомологічній ендогеноті, то утвориться рекомбінант у результаті інтеграції екзо- і ендогеноти, тобто вбудовування екзо- в ендогеноту =>рекомбінантна молекула.

2. Якщо спарювання двох генетичних елементів неможливо, то:

а. Екзогенота містить свій власний реплікон:

- автономна й незалежна від генетичного матеріалу клітини реплікація;

- поширення й спадкування генетичного матеріалу випадково;

б. Екзоген не містить генів реплікації:

- відсутність розмноження;

- відходить однієї із двох дочірніх клітин при розподілі.

Популяція звільниться від екзогеноти, що розчиняється в популяції.

3. Рестрикція - деградація внесеного матеріалу під дією ферментів рестрикції.

Методи генетичної інженерії in vitro:

Інструментами розроблених методів маніпуляції in vitro є:

• ферменти (діють на ДНК)

• вектори (переносять гени)

• штучні олігонуклеотиди (лінкери, адаптери, праймери, промотори, зонди)

Ферменти - основний інструмент технології рекомбінантних ДНК, поділяються на групи: