- •5.Методи отримання генів
- •Фосфоромідитний метод
- •Синтез на матричної рнк за допомогою зворотної транскрипції.
- •Одержання генів із природного матеріалу (днк) за допомогою рестриктаз.
- •6.Визначення довжини нуклеотидного фрагмента Метод Сенджера ( ферментативне секвенування)
- •8) Вектори на основі фага Лямбда Лямбда
- •9) Адаптери та лінкери
- •10) Методи введення днк в клітину
- •Ферменти які синтезують фрагменти днк на матриці рнк.
- •Ферменти, які застосовуються для приготування гібридизаційних проб.
- •11) Вектори впровадження
- •16) Рестрикційні карти
- •17) Бібліотека генів (клонотека)
- •18) Метод «Прогулянка по хромосомі»
- •19) Дріжджові вектори
- •20) Як поєднати тупі (липкі) кінці
- •21) Як підтвердити ефективність трансляції чужорідного генетичного матеріалу
- •22) Метод вдосконалення векторів
- •23) Ідентифікація клонів
- •24) Типи векторів
- •25) Перспективи використання гі в сучасній селекції.
- •26) Полімеразна ланцюгова реакція
- •27) Метод з’єднання франментів днк в гібридній молекулі.
- •28) Введення в рослинну клітину (без векторів)
- •29) Вектори на основі віруса cb-4o
8) Вектори на основі фага Лямбда Лямбда
Бактеріофаг λ може існувати в 4-х різних формах:
-
лінійна - геном перебуває всередині фагової частки;
-
кільцева - утворюється після введення фага в клітину;
3) інтегрована форма - лінійна ДНК профага є пермутованою відносно ДНК фагової частки
4) конкатемерна форма - виникає під час реплікації ДНК фага λ по типу колеса, що котиться. Виходять довгі конкатемери, які складаються з безлічі копій генома бактеріофага λ, які з'єднуються по cos-сайтах.
Типовий вектор отриманий після розрізання Eco I бактеріофага λ. Розріз проводять у ділянці, суттєвій для лізогенії (заштрих.). Утворюються 3 фрагменти ДНК: ліве, праве плече і центральна частина. Ліве й праве плече змішують із фрагментами - вставками, отриманими за допомогою рестриктази Eco I. Внаслідок такого вбудовування утвориться конкатемер, що містить чужорідний ген. Після цього вводять у реакційну суміш конкатемер, фермент терминазу і вона починає запаковувати в окремі фагові блоки генетичний матеріал, що перебуває між cos-сайтами. Одержують велику кількість окремих фагових часток.
На основі бактеріофага λ конструюють вектори заміщення й впровадження. Заміщення—два розрізи і вставка (заміщення) фрагмента , несуть 2 ділянки рестрикції і їхня ємність ≈ 20 т. н. п.. Впровадження—один розріз і вставка фрагмента, максимальна ємність 15 т. н. п. і несуть 1 сайт для впізнавання.
На основі бактеріофага λ були сконструйовані його похідні.
-
Косміди - являють собою невеликі плазміди, в які in vitro введені cos-сайти ДНК фага λ. Звідси назва всього типу векторів (cosmid). В ДНК нормальних фагових часток cos-сайти розташовані на кінцях молекул, вони розділяють мономери фагової ДНК в конкатемерах, що поєднують кілька з'єднаних "голова до хвоста" мономерів, які є попередниками зрілих фагових ДНК перед упакуванням у фагові частки. В таких конкатемерах сусідні cos-сайти розташовуються на відстані 35-45 т.н.п. один від одного і містять між собою весь фаговий геном. У процесі упаковування cos-сайти впізнаються компонентами ферментативної системи і по них відбувається послідовне відрізання упакованої у фагову частку лямбда-ДНК від іншої із ДНК конкатемера.
-
Фазміди - являють собою векторні молекули ДНК, які містять генетичні елементи плазмід і хромосом бактеріофагів. Вони можуть мати ємність у відношенні до клонованої ДНК, характерної для лямбда-векторів, і існувати в певних умовах в бактеріальних клітинах у вигляді плазміди або ж упаковуватися у фагові частки in vivo при зміні цих умов.
Недолік методу молекулярного клонування на основі космічних векторів : в одній рекомбінантній молекулі ДНК можуть об'єднатися мало чужорідних ДНК, що значно ускладнює відбір у клітині-реципієнті.
Фазміди - на відміну від космид, є дійсними гібридами між плазмідою і фагом. Кінці - фрагменти бактеріофагу λ, а середина – лінералізована плазміда. Тому вона може існувати в одних умовах як бактеріофаг λ, а в інших як плазмида. Ємність менша, ніж у космід.