Синтез на матричної рнк за допомогою зворотної транскрипції.

Більше швидкий і простій, чим хімічний. У пробірку вносять 4 дезоксинуклеотида + три фосфати, зворотну транскриптазу, мРНК, затравку та іони Mg²⁺ або Mn²⁺.

На мРНК синтезується ланцюг ДНК, проводять м'який гідроліз, звільняють ДНК і за допомогою ДНК- полімерази синтезують комплементарний ланцюг.

У такий спосіб були отримані гени, які кодують гормон росту, інсулін, інтерферон.

Недолік - досить низький вихід продукту (~5% від мРНК)

Одержання генів із природного матеріалу (днк) за допомогою рестриктаз.

Дуже важко підібрати фрагмент, де б даний ген був присутній. Складність представляє мозаїчна структура генів у еукариот, тому інтрони потрібно виділити, щоб клонувати ген у прокаріот. Проте цей метод найпоширеніший.

6.Визначення довжини нуклеотидного фрагмента Метод Сенджера ( ферментативне секвенування)

В 1977 р. Сенджер запропонував спосіб ферментативного секвенування, що одержав назву метода термінуючих аналогів трифосфатів. Потужніший і більш технологічний, цей спосіб, трохи модифікований, застосовується дотепер. В основі методу теж лежить ферментативне копіювання за допомогою фрагмента Кленова ДНК полімерази I з E.coli. В якості праймерів використовували синтетичні олігонуклеотиди. Специфічну термінацію синтезу забезпечували додаванням у реакційну суміш крім чотирьох типів dNTP (один із яких був радіоактивно мічений по альфа положенню фосфату) ще й одного з 2',3’-дидезоксинуклеозидтрифосфатів (ddATP, ddTTP, ddCTP або ddGTP), що здатний включатися в зростаючий ланцюг ДНК, але не здатний забезпечувати подальше копіювання через відсутність 3’-ОН групи. Відношення концентрацій dNTP/ddNTP автори підбирали експериментально, так, щоб у підсумку одержати набір копій ДНК різної довжини. Таким чином, для визначення первинної структури досліджуваного фрагмента ДНК було потрібно провести чотири реакції копіювання: по одному типу термінаторів в кожній з реакцій. Після цього отримані продукти розганяли в поліакриламідному гелі на сусідніх доріжках і по розташуванню смуг визначалася послідовність нуклеотидів.

7 ПЦР. ПЦР - метод аналізу ДНК. Ціль - одержання копій коротких ділянок ДНК, специфічних для конкретного м/о. ПЦР - багаторазове збільшення числа копій (ампліфікація) специфичної ділянки ДНК за допомогою Днк-полімерази.

Для ампліфікації необхідні :

1. Днк-матриця (ДНК або її частина, що містить шуканий специфічний фрагмент);

2. Праймери (синтетичні олігонкулеотиди (20-30 нукл. пара), комплементарні послідовностям ДНК на границях обумовленого специфічного фрагмента).

3. Суміш 4 дезоксинуклеотидтрифосфатов (днтф)

4. Фермент Taq-полімераза (термостабільна Днк-полимераза, що каталізує подовження ланцюгів праймерів шляхом послідовного приєднання нуклеотидних основ до зростаючого ланцюга синтезованої ДНК)

5. Буферний розчин (Mg2+, для підтримки активності ферменту)

3 етапи(один цикл):

1) Денатурація ДНК (розплетення подвійної спіралі), при 93-95°C у теч 30-40 сек.

2) Приєднання праймерів (отжиг). Для кожної пари праймеров існує своя темп-ра отжига(в інт. 50-65°С). Час отжигу -20-60 сек.

3) Добудовування ланцюгів ДНК. Комплементарне, від 5’ до 3’-кінця ланцюга в протилежних напрямках, починаючи з ділянок присоединенияния праймеров. Матеріал для синтезу - дНТФ. Фермент – термостабільна ДНК-полімераза (Taq-полімераза), 70-72°С, час - 20-40 сек.

Нові ланцюги ДНК із 1го циклу служать матрицями для 2-го циклу ампліфікації => нагромадження ампліконів у р-ні по формулі 2n, де n-число циклів.

Далі візуальна детекция фрагмента методом електрофорезу в агарозному гелі. Процес ампліфікації проводиться в термостаті (ампліфікаторі) з автоматичною зміною температур.

Області застосування методу ПЦР:

1 клінічна медицина:

1.1 діагностика інфекцій,

1.2 виявлення мутацій, у тому числі діагностика спадкоємних захворювань,

1.3 генотипування,

2 екологія (як спосіб моніторингу стану і якості об'єктів навколишнього середовища й продуктів харчування)

3 визначення трансгенных організмів (ГМО)

4 ідентифікація особистості, установлення батьківства, криміналістика

5 загальна й приватна біологія,

6 фармакологія,

7 ветеринарія.