25) Перспективи використання гі в сучасній селекції.

Генетична інженерія (ГІ) - напрямок досліджень у молекулярній біології та генетиці, кінцевою метою яких є одержання за допомогою лабораторних прийомів організмів з новими, у т.ч. не зустрічаючихся в природі, комбінаціями спадкових властивостей. Це конструювання in vitro функцій активних генетичних структур (рекомбінантних ДНК), а також створення штучних генетичних програм.

Генетична інженерія поділяється на:

• генетичне конструювання in vivo - це традиційні методи (мутогенез, кон'югація, трансформація, трансдукція);

• генетичне конструювання in vitro.

26) Полімеразна ланцюгова реакція

ПЦР - метод аналізу ДНК. Ціль - одержання копій коротких ділянок ДНК, специфічних для конкретного м/о. ПЦР - багаторазове збільшення числа копій (ампліфікація) специфичної ділянки ДНК за допомогою Днк-полімерази.

Для ампліфікації необхідні :

1. Днк-матриця (ДНК або її частина, що містить шуканий специфічний фрагмент);

2. Праймери (синтетичні олігонкулеотиди (20-30 нукл. пара), комплементарні послідовностям ДНК на границях обумовленого специфічного фрагмента).

3. Суміш 4 дезоксинуклеотидтрифосфатов (днтф)

4. Фермент Taq-полімераза (термостабільна Днк-полимераза, що каталізує подовження ланцюгів праймерів шляхом послідовного приєднання нуклеотидних основ до зростаючого ланцюга синтезованої ДНК)

5. Буферний розчин (Mg2+, для підтримки активності ферменту)

3 етапи(один цикл):

1) Денатурація ДНК (розплетення подвійної спіралі), при 93-95°C у теч 30-40 сек.

2) Приєднання праймерів (отжиг). Для кожної пари праймеров існує своя темп-ра отжига(в інт. 50-65°С). Час отжигу -20-60 сек.

3) Добудовування ланцюгів ДНК. Комплементарне, від 5’ до 3’-кінця ланцюга в протилежних напрямках, починаючи з ділянок присоединенияния праймеров. Матеріал для синтезу - дНТФ. Фермент – термостабільна ДНК-полімераза (Taq-полімераза), 70-72°С, час - 20-40 сек.

Нові ланцюги ДНК із 1го циклу служать матрицями для 2-го циклу ампліфікації => нагромадження ампліконів у р-ні по формулі 2n, де n-число циклів.

Далі візуальна детекция фрагмента методом електрофорезу в агарозному гелі. Процес ампліфікації проводиться в термостаті (ампліфікаторі) з автоматичною зміною температур.

Області застосування методу ПЦР:

1 клінічна медицина:

1.1 діагностика інфекцій,

1.2 виявлення мутацій, у тому числі діагностика спадкоємних захворювань,

1.3 генотипування,

2 екологія (як спосіб моніторингу стану і якості об'єктів навколишнього середовища й продуктів харчування)

3 визначення трансгенных організмів (ГМО)

4 ідентифікація особистості, установлення батьківства, криміналістика

5 загальна й приватна біологія,

6 фармакологія,

7 ветеринарія.

27) Метод з’єднання франментів днк в гібридній молекулі.

ДНК-лігаза - фермент, що каталізує утворення фосфодиефірних зв'язків між сусідніми нуклеотидами в молекулі ДНК. В технології рекомбінантних ДНК використовуються в основному дві ДНК-лігази: E. coli і Т4. Обидві лігази служать для репарації одноланцюгових розривів у дуплексній молекулі ДНК і для з'єднання двох молекул ДНК шляхом лігування тупих або липких кінців. ДНК-лігаза вперше виділена Б. Вейсом і К. Річардсоном в 1966 р.

Також використовується РНК-лігаза фага Т4. Цей фермент бере участь у синтезі олігорібо- і олігодезоксирібонуклеотидів без виникнення матриці, а також поєднує розриви в ланцюгах ДНК. Також РНК-лігазу використовують для введення радіоактивної мітки в 3’- кінець РНК.