СОВЕТУЮ Вычитать и отредактировать под себя ) повторяется инфа … и вопросы 10-15 будут поже.

1. Ферментативна селекція(види): Ферменти - основний інструмент технології рекомбінантних ДНК, поділяються на групи:

1. Ферменти які синтезують фрагменти ДНК на матриці РНК.

2. Ферменти за допомогою яких здійснюється об'єднання фрагментів ДНК.

3. Ферменти, які використовують для одержання фрагментів ДНК.

4. Ферменти, які дозволяють здійснити зміни структури кінців фрагментів ДНК.

5. Ферменти, які застосовуються для приготування гібридизаційних проб

2. Блотинг по Саузерну: Блотинг по Саузерну—метод одержання спеціалізованої або повної бібліотеки генів (ДНК перед гібридизацією переносять із гелю на більш підходящу підкладку). Метод дозволяє встановити кількість копій даного гена в геномі, а також з'ясувати чи є в даному гені сайти для певної рестриктази і їхня кількість. Часто використовують для попереднього аналізу гена.

Аналогічний підхід, але стосовно РНК називається мозерен-блотингом.

Перенос білкових молекул, отриманих за допомогою гель-електрофорезу на твердій основі, називається вестерн-блотинг.

3.Основні класи рестриктаз: Ендонуклеази рестрикції (рестриктази) діляться на три класи:

1. ферменти, які впізнають певну послідовність і розрізають ДНК недалеко від цієї послідовності, але не в специфічній ділянці (I).

2. ферменти, що впізнають певну послідовність і розрізають подвійну спіраль ДНК в строго фіксованому місці всередині цієї послідовності (II).

3. ферменти, що впізнають певну послідовність і розрізають спіраль ДНК, відступаючи певну кількість нуклеотидів від кінця цієї послідовності (III).

Рестриктази II класу є основним інструментом при конструюванні рекомбінантних молекул ДНК і при аналізі структури ДНК.

По способу розрізання рестриктази поділяються на:

• ферменти, що розрізають зі зміщенням.

• ферменти, що розріжуть точно в сайті рестрикції.

Серед ферментів, які виділені з різних мікроорганізмів, зустрічаються такі, що впізнають на ДНК ті самі послідовності. Ці рестриктази називають ізошизомери. Розрізняють ізошизомерію:

• справжню, коли ферменти впізнають ту саму послідовність і ріжуть ДНК в тому самому місці.

• несправжні, ферменти впізнають одну й ту ж послідовність, але ріжуть ДНК в різних точках всередині цього сайту впізнавання.

4.Фаг М13

М13 – фаг E.coli (коліфаг), що містить кільцеву одноланцюгову молекулу ДНК. М13 фаги інфікують тільки штами E. coli з F-пілями, що містять F-фактор. Клітини E. coli з фагом не лізують, але ростуть повільно. Після проникнення одноланцюгової ДНК фага в клітину вона перетворюється у двуланцюгову реплікативну форму, що швидко розмножується доти, поки не накопичиться кодуємий фагом специфічний білок, що зв'язується з ДНК та зупиняє синтез комплементарного ланцюга ДНК. Після цього тільки та одноланцюгова ДНК продовжує синтезуватись, що запаковується на клітинній мембрані хазяїна в капсидні білки. Потім зформовані фаги вивільняються з клітини. Численні похідні М13 використовуються в якості клонуючих векторів.

Як вектор використовується саме реплікативна форма. Вбудовування чужерідних генів проводиться в ділянку, що не кодує, щоб не пошкодити ori-ділянку.

Системи, в яких М13 використовується як вектор, мають особливості:

1. бактеріофаг М13 може включати дуже великі вставки, оскільки впаковування не залежить від геному;

2. ці вектори можуть перетворюватись у велику кількість одноланцюгових;

3. чужерідний фрагмент може вбудовуватись в 2-х орієнтаціях.

Основне застосування М13 - для секвенування по методу Сенджера.

5.Методи отримання генів

Існують три способи:

1. Хіміко-ферментативний синтез

2. Із ДНК за допомогою рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз)

3. Синтез генів на матриці РНК за допомогою зворотної транскрипції.

Перший хімічний синтез був здійснений в 1969 р. Зорано зі співробітниками. Це був ген аланина тРНК дріжджів. Такий синтетичний ген був функціонально не активний (не мав регуляторних елементів). В 1976 р. ці ж дослідники синтезували ген супресорної тирозинової тРНК і до нього були приєднані промотор, термінатор і тетрануклеотиди. Цей ген був функціонально активним. Його вбудували в геном мутантного фага Т4 (нонсенс-мутація). Після вбудування пройшла супрессия нонсенс-мутації.

Ще один приклад - хімічний синтез оператора lac. оперона Е. соlі. Цей оператор був вбудований в плазмиду і в бактерію. Після введення репресора виникає недолік блокування оперонов, і починають синтезуватися ферменти, які утилізують лактозу. Але синтезувати хімічно великий ген не доцільно (дорого), тому синтезують зонди, лінкери, праймери - невеликі фрагменти.

Для хімічного синтезу використовують 2 методи: 1)фосфаттриефірний, 2) фосфіттриефирний - більше розповсюджений.

В обох випадках вихідним матеріалом є дезоксирібонуклеотиди. Ці методи автоматизовані, установка - синтезатор ДНК. Всі реакції здійснюються послідовно на одному реакційному стовпчику, всі операції контролюються за допомогою комп'ютера.

Головною умовою є захист реакційних груп дезоксирібонуклеотидів, які не приймають участі в реакції.

Захищають:

• аміногрупи дезоксиаденозину і дезоксицитозину - бензолюють; гуанозину - додають залишок ізомасляної кислоти; тимін не модифікують (не має аміногруп)

• 5'-гідроксильні групи - диметокситритил: ОН-групи утворюють ефірний зв'язок.

Вивільняють:

• амінокислоти - за допомогою лужного гідролізу;

• метокситретил - за допомогою м'яких кислот.

Фосфоромідитний метод

Метод Карузерса, відомий як фосфорамідитний метод хімічного синтезу у твердій фазі, дотепер залишається основою більшості комерційних виробництв ДНК. Процес починається з фіксації першого нуклеотида на інертному твердому носії (звичайно пористій скляній кульці). Після обробки трихлороцтовою кислотою він набуває здатності приєднувати наступний нуклеотид, доданий у реакційну суміш. Далі знову проводять обробку кислотою, приєднують наступний нуклеотид і т.д. Багаторазово повторюючи такий цикл, можна синтезувати будь-яку нуклеотидную послідовність, причому імовірність помилки складає приблизно 10² ступені.

Процесс складається з великої кількості циклів, а цикли складаються з 5 етапів:

1. приєднання першого нуклеозиду до носія;

2. детритилювання (відщеплення 5’-ДМТ для звільнення реакційноздатної 5’- гідроксильної групи);

3. активація і приєднання наступного нуклеозиду у вигляді фосфорамідиту тетразолом;

4. захист груп нуклеозидів, не пов'язаних з фосфорамідитом ацетилуванням;

5. стабілізація фосфіттриефірного зв'язку між нуклеозидами - окинення йодною сумішшю.

Ферментативний синтез не такий складний, оскільки не вимагає захисних з'єднань, але важко піддається контролю. Використовують ферменти - полінуклеотидфосфатазу, субстрати - дезокирібонуклеотидфосфати, матриця не потрібна, потрібні праймери. За один раз приєднується 1 або 2 дезоксирібонуклетидфосфатних залишків.

Хімічний і ферментативний синтез застосовуються звичайно разом.