11) Вектори впровадження

На основі бактеріофага λ конструюють вектори заміщення й впровадження. Впровадження—один розріз і вставка фрагмента.

Вектори впровадження - максимальна ємність 15 т. н. п. і несуть 1 сайт для впізнавання.

12. Вектор заміщення—вектор, зконструйований на основі бактеріофага λ, який несе 2 або більше сайтів рестрикції (23-24 т.п.н).

13)Метод Максама-Гілберта або хімічне секвенування-метод секвенування, заснований на специфічних розривах фрагмента ДНК, радіоактивно міченого з одного кінця. Препарат міченої ДНК розділяли на чотири аліквоти і кожну обробляли реагентом, що модифікує одну або дві з чотирьох основ. При взаємодії з хім. реагентом основа пошкоджується, а потім вилучається. Утворюється набір мічених фрагментів, розміром від розриву основи до міченої молекули. Наступний електрофорез у поліакриламідному гелі дозволяє відновити повну структуру досліджуваного фрагменту. Аналіз за допомогою радіографії (для рад. мітки) або за допомогою поточної детекції(для флюор.мітки)

14)Метод Сенджера-спосіб ферментативного секвенування в основі якого лежить ферментативне копіювання за допомогою фрагмента. Для кожної нормальної основи синтезується ненорм. аналог, він включається в ланцюг і на ньому синтезує обривки.

В методі використовуються:

-1-ланцюгова ДНК;

-короткий праймер(затравка)

-набір нуклеотидів;

-набір природніх аналогів нуклеотидів, що є термінаторами росту ДНК, бо не можуть утвор. фосфодиефірний зв. з наступним нуклеотидом.

-ДНК-полімераза.

. Таким чином, для визначення первинної структури досліджуваного фрагмента ДНК було потрібно провести чотири реакції копіювання: по одному типу термінаторів в кожній з реакцій. Після цього отримані продукти розганяли в поліакриламідному гелі на сусідніх доріжках і по розташуванню смуг визначалася послідовність нуклеотидів. Аналізують комплементарний ланцюг.

Вектор заміщення—вектор, зконструйований на основі бактеріофага λ, який несе 2 або більше сайтів рестрикції (23-24 т.п.н).

15. Човниковий вектор - плазмідний клонуючий вектор, що містить послідовності ДНК, які дозволяють його селекцію та автономну реплікацію у двох різних організмах - хазяях різних біологічних видів (напр., S. cerevisiae та E. coli або A.tumefaciens й E. coli). Містять 2 ділянки ori, що відповідають кожному з двох хазяїв та містять гени, необхідні для реплікації в обох хазяйських клітинах.

Обмеження:

• Чужа частина ori не повинна заважати реплікації в хазяїні;

• Потрібно враховувати те, що ці вектори повинні мати однакову стабільність в обох типах хазяїв;

• Системи рестрикції - модифікації двох хазяїв не повинні сприймати цю молекулу як чужорідну;

Більшість еукариотних векторів є човниковими (напр. YACS - для дріжджів, BACS- для бактерій);

16) Рестрикційні карти

Рестрикційна карта - це схема, на яку нанесені сайти розпізнавання різних рестриктаз, дана лінійна послідовність цих сайтів і відстань між ними в парах нуклеотидів для коротких фрагментів, у тис. пар нуклеотидів для довгих фрагментів (н.п., т.н.п.).

Для побудови рестрикційної карти використовують гібридизацію за методом Е. Саузерна. 1) Клонований фрагмент ДНК окремо або у складі вектора отримують у препаративних кількості; 2) Його обробляють відповідними рестриктазами; 3) Продукти рестрикції поділяють електрофорезом в агарозному гелі. 4) Кількість рестрикційних фрагментів ДНК, що утворилися, які виявляються після фарбування бромистим етидієм у вигляді флуоресціюючих смуг в ультрафіолетовому світлі, відповідає кількості сайтів рестрикції в тому випадку, якщо розходження в розмірах утворилися фрагментів ДНК достатні для їх розділення при електрофорезі. 5) Розміри рестрикційних фрагментів оцінюють шляхом порівняння їх електрофоретичної рухливості з фрагментами ДНК відомих розмірів. 6) Отримавши інформацію про кількість сайтів рестрикції в гені, далі визначають їх взаємне розташування. Для цього в якості зондів вибирають короткі фрагменти ДНК і після введення в них радіоактивних міток, гібридизують з рестрикційними фрагментами ДНК, які після електрофоретичного розділення в агарозному гелі були перенесені на нітроцелюлозні або нейлонові фільтри. 7) По завершенні гібридизації положення фрагментів ДНК, що зв'язали мітку, на фільтрах виявляють за допомогою авторадіографії. Отримання такої інформації про належність конкретних фрагментів ДНК, що утворилися під дією різних рестриктаз, до 5'-або 3'-кінцевих частин досліджуваної послідовності нуклеотидів зазвичай буває достатнім для визначення взаємного розташування різних сайтів рестрикції на рестрикційних картах.

Перевагою рестрикційних карт є те, що інформація, яка в них міститься, може бути використана безпосередньо для клонування фрагментів геному, що нас цікавлять.

При побудові рестрикційних карт є 2 підходи:

• метод декількох рестриктаз

• метод однієї рестриктази, метод неповного гідролізу

Ці карти потрібні для встановлення розміщення ділянки, що мутувала. Дозволяє судити про розміри генів, а також встановити, які рестриктази необхідно використати для вирізання необхідного гена, для з'ясування питань систематики, як рослин так і тварин.