17) Бібліотека генів (клонотека)

Бібліотека генів (клонотека) - це колекція фрагментів ДНК, що в організмі представлена більшою кількістю копій.

Бібліотеки бувають:

• повні - містять із певним ступенем імовірності весь геном організму;

• спеціалізовані - це банк копій якоїсь окремої ділянки генома.

При створенні клонотек треба мати хоча б один ген. Проводять фрагментацію ДНК-рестриктазами. Далі шляхи створення бібліотек розходяться.

Для створення повної бібліотеки цією ж рестриктазою ріжуть вектори; змішують фрагменти вектора і необхідні фрагменти ДНК → вони з'єднуються і утворюють суміш рекомбінантних ДНК (рДНК); цією сумішшю трансформують клітини E. соlі. Різні бактеріальні клітини одержують різні копії рДНК і починають їх рекомбінувати. Далі відбирають необхідний ген за допомогою зонда або за допомогою прийому “прогулянка по хромосомі”. Як зонди використовують мРНК, кДНК, олігонуклеотиди.

Для створення спеціалізованої бібліотеки 1-й етап такий же. Проводять електрофорез – розділяють фрагменти; проводять секвенування потрібного фрагмента, ампліфікацію потрібного фрагмента in vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

18) Метод «Прогулянка по хромосомі»

«Прогулянка по хромосомі», полягає в послідовному відборі клонів, які несуть перекриваються в кінцевих ділянках фрагменти ДНК з певної області геному. Виділивши клони, наприклад, шляхом скринінгу бібліотеки за допомогою маркерної ДНК, зчепленої з потрібним геном, їх використовують в якості ДНК-зондів для пошуку інших клонів з послідовностями, що перекриваються. В результаті отримують набір фрагментів, що повністю перекривають область пошуку гена, - контіги (група з декількох послідовно з'єднаних секвенованих ділянок ДНК). За допомогою методів фізичного картування встановлюють розмір перекриваються ділянок (у п.н.) і будують фізичну карту даної області. Незважаючи на те, що прогулянку можна здійснювати в двох напрямках, при використанні рестрикційної карти, ефективність цього методу мала. При використанні космідних бібліотек кожен крок зондування в одному напрямку дорівнює 20 т.п.н. (0,02 Мб), а через наявність в геномі повторюваних і послідовностей, що важко клонуються, можна пройти близько 200-300 т.п.н. (0,2-0,3 Мб).

19) Дріжджові вектори

В якості векторів для перенесення ДНК в еукаріотичні клітини використовують дріжджові плазміди (єдині плазміди, знайдені в еукаріотичних клітинах) і різні еукаріотичні віруси (найчастіше ретровіруси, аденовіруси або аденоассоціірованние віруси). Sach. Сеrеvіsіае - один з найбільш вдалих об'єктів серед еукариотичних клітин. Переваги:

• Невеликий геном

• Короткий час генерації

• Генетична й фізіологічна вивченість

• Наявність сильних промоторів

• Наявність власних плазмід

• В клітинах здійснюється велика кількість посттрансляційних модифікацій

• Офіційно признані безпечними.

У дріжджів є 3 типи плазмід:

• 2- мікронна

• 3- мікронна

• мітохондріальна (24 мікрона)

2-мікронна плазміда найденна в багатьох штамів, кільцева, існує в кількості 50-60 копій на геном. ДНК її становить 3% від всієї ДНК. У нормі не інтегрує із дріжджовими хромосомами. Містить 2 інвертовані повтори на кінцях близько 600 п.н.

3-мікронна плазмида - розміри близько 9500 п.н., кількість копій у клітині ≈10. Як вектор застосовують рідко.

Мітохондріальна плазміда ~75000 п. н., кількість копій у клітині 1-50. Ділянки, що кодують, розділені більшими, що не кодують. Дріжджові вектори -це гібриди. Дріжджові плазміди - не мають селективних маркерів і їхнє використання як векторів стало можливим після того, як була відкрита можливість вбудовування в них хромосомних генів.

Типи векторів:

• Вектори інтеграції YIр – бактеріальні вектори, оскільки дріжджова ДНК представлена одним з генів. Не здатні реплікуватись в дріжджових клітинах, але здійснюють їхню трансформацію шляхом інтеграції хромосом.

• Еписомні вектори YЕр – сконструйовані на базі 2-мікронної ДНК (0-мікронна). Складається із плазмиди pBR322, реплікатора 2-мікронної ДНК і селективного дріжджового маркера. Ці вектори дозволяють клонувати чужорідні гени в клітинах E. сoli і потім досліджувати їхню експресію в дріжджових клітинах, не стабільні.

• YRp або ARS – вектори, що мають хромосомні репликаторні послідовності (ARS-послідовності).

Цих елементів може бути багато в хромосомі, ARS - вектори мають ділянку ori від дріжджового геному.

• Мікрохромосома YСр – найбільш перспективний вектор для клонування. Містить ARS і CEN-послідовності (розмір 500 п. н.). CEN-послідовність - це центромери дріжджової хромосоми (регулюють кількість копій). Присутній дріжджовий ген як селективний маркер і дріжджові сайти рестрикції.

• Лінійна мініхромосома YLр - у попередній вектор вводять додаткові теломерні ділянки (нуклеотидні послідовності на кінцях хромосоми). Це лінеаризована мініхромосома.

• На основі епісомних векторів YEр були створені спеціальні експресуючі вектори – сендвіч-вектори. Вони містять дріжджовий промотор, сайти рестрикції і термінатор транскрипції. Чужорідний ген ставлять під контроль сильного промотору і він починає добре експресуватись в E coli і у дріжджах.