6. Ферменти які синтезують фрагменти днк на матриці рнк.

РНК-залежна ДНК-полімераза (зворотна транскриптаза) - фермент класу трансфераз, що здійснює ДНК-ДНК-залежний синтез ДНК і синтез ДНК на матриці РНК (зворотна транскрипція). Здатна функціонувати тільки при наявності затравки. Використовується для клонування послідовностей нуклеотидів мРНК еукаріот.

7. Ферменти за допомогою яких здійснюється об'єднання фрагментів ДНК. ДНК-лігаза - фермент, що каталізує утворення фосфодиефірних зв'язків між сусідніми нуклеотидами в молекулі ДНК. Використовуються в основному дві ДНК-лігази: E. coli і Т4.

8. Ферменти, які використовують для одержання фрагментів ДНК. Ендонуклеази рестрикції (рестриктази) діляться на три класи. Найчастіше застосовують рестриктазу ІІ класу при конструюванні рекомбінантних молекул ДНК і при аналізі структури ДНК.

9. Ферменти, які дозволяють здійснити зміни структури кінців фрагментів ДНК. Нуклеази, фосфатази,

10. Ферменти, які застосовуються для приготування гібридизаційних проб.

Одержання генів із природного матеріалу (ДНК) за допомогою рестриктаз.

Дуже важко підібрати фрагмент, де б даний ген був присутній. Складність представляє мозаїчна структура генів у еукариот, тому інтрони потрібно виділити, щоб клонувати ген у прокаріот. Проте цей метод найпоширеніший.

Створення рекомбінантних молекул ДНК – це об'єднання отриманого гена й вектора.

Вектор – це молекула ДНК, що здатна переносити і стабільно підтримувати в реципієнтних клітинах чужорідну генетичну інформацію.

Вектор повинен відповідати таким вимогам:

1. мати невеликий розмір;

2. мати здатність до самостійного існування в клітині (бути самостійним репліконом);

3. наявність сайтів рестрикції – для розщеплення рестриктазами. Сайти рестрикції не повинні знижувати здатність до самостійної реплікації.

4. Кожна векторна молекула повинна нести хоча б один селективний маркер, що дозволяє фенотипу виявити в клітині хазяїна вектор. Як селективні маркери використовують гени стійкості до антибіотиків.

У якості векорів використовують плазміди, віруси, фаги, мітохондрії, хлоропласти.

Залежно від завдань, вектори поділяються:

1) звичайні, за допомогою яких гени розмножуються в достатній кількості.

2) спеціалізовані вектори, які використовуються для експресії генів, для одержання бібліотек генів.

Плазмідні вектори. Дають можливість одержувати від декількох десятків до декількох тисяч векторів молекул на клітину. Використовуються плазміди з ослабленим контролем. У плазмідні вектори можна включити фрагменти будь-яких розмірів, але не більше 15000 нукл. (втрачається стабільність). Ідеальний плазмідний вектор повинен:

1. мати невелику кількість ДНК;

2. реплікація його повинна здійснюватись з ослабленим контролем (забезпечувати велику кількість копій);

3. мати якнайбільше селективних маркерів (як мінімум 2);

у векторі краще мати одиничні сайти для декількох рестриктаз, чим кілька сайтів для однієї рестриктази.

Фагові вектори більш ефективні для клонування великих фрагментів ДНК. Відбір іде безпосередньо за утворенням бляшок на газоні чутливих клітин-хазяїв. Найрозповсюдженими векторами для E. coli є бактеріофаг λ і М13.