116. Люминесцентный анализ. Люминесцентные метки и зонды. Медицинское применение люминесцентных методов исследования.

Определение природы и состава вещества по спектру его люминесцентного излучения, называется люминесцентным анализом. Люминесцентный анализ позволяет обнаруживать люминесцентные вещества в количестве до 10^-10 г. Люминесцентный анализ используют для обнаружения начальной стадии порчи продуктов, сортировки фармакологических препаратов и диагностики некоторых заболеваний. Под действием ультрафиолетового излучения флуоресцируют многие ткани организма (ногти, зубы, непигментированные волосы, роговая оболочка, хрусталик глаза и другие). В некоторых случаях по характеру свечения можно отличить патологически измененные ткани. Характерное свечение дают бактериальные и грибковые колонии. В связи с этим люминесцентный анализ применяется при диагностике многих заболеваний, особенно в области дерматологии.

Если флуоресцирующие молекулы вводятся в исследуемую систему как индивидуальные вещества, которые затем сами в соответствии со своими свойствами распределяются в ней, то такие молекулы называют флуоресцентными зондами. Примером применения флуоресцентных зондов может служить внутривенное введение пациентам флуоресцеина. Он с током крови разносится по всему организму и диффундирует в дерму и эпидермис. По скорости появления флуоресценции в поверхностных тканях судят об участках тела с пониженным кровообращением, в них флуоресцеин появляется позже, чем в участках тела с нормальным кровообращением.

В других случаях флуоресцирующие красители ковалентно связывают с какими-либо молекулами и затем вводят их в исследуемую систему. Такие молекулы называют флуоресцентными метками. Примером может служить использование флуоресцентно-меченых антител. Если добавить такие антитела к суспензии смеси клеток, то они связываются только с теми из них, на поверхности которых находятся специфические к данному антителу антигены. Возникает яркая флуоресценция определенных клонов клеток, хорошо видная в люминесцентных микроскопах. Подсчет таким образом меченных флуоресцирующих клеток используется в иммунологических исследованиях крови.

117. Поглощение света и его законы. Показатель поглощения, коэффи циент пропускания, оптическая плотность.

Поглощением света называют ослабление интенсивности света при прохождении через любое вещество вследствие превращения световой энергии в другие виды энергии.

Поглощение кванта света происходит при его неупругом столкновении с молекулой (атомом), приводящем к передаче энергии фотона веществу, и является случайным событием. Вероятность поглощения кванта света образцом вещества толщиной l оценивается величиной коэффициента поглощения 1  Т, равного отношению интенсивностей поглощенного света I_п = I₀  I к интенсивности падающего I₀ где I — интенсивность прошедшего света, —коэффициент пропускания.

--закон поглощения света Бугера. Коэффициент k_ называют натуральным показателем поглощения, его величина обратна расстоянию, на котором интенсивность света ослабляется в результате поглощения в среде в е раз.

-- закон Бугера—Ламберта—Вера. (24.8)

Закон Бугера—Ламберта—Бера используют для фотометрического определения концентрации окрашенных веществ. Для этого непосредственно измеряют потоки падающего и прошедшего через раствор монохроматического света (концентрационная колориметрия), однако определенный таким образом коэффициент пропускания Т (или поглощения 1 - Т, см. (24.1)) неудобен, так как он из-за вероятностного характера процесса связан с концентрацией нелинейно. Поэтому в количественном анализе обычно определяют оптическую плотность (D) раствора, представляющую десятичный логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания,

Оптическая плотность удобна тем, что она линейно связана с концентрацией определяемого вещества (рис. 24.2, б).

Закон Бугера—Ламберта—Бера выполняется не всегда. Он справедлив при следующих предположениях: 1) используется монохроматический свет; 2) молекулы растворенного вещества в растворе распределены равномерно; 3) при изменении концентрации характер взаимодействия между растворенными молекулами не меняется (иначе фотофизические свойства вещества, в том числе и значения s и , будут изменяться); 4) в процессе измерения не происходят химические превращения молекул под действием света; 5) интенсивность падающего света должна быть достаточно низка (чтобы концентрация невозбужденных молекул практически не уменьшалась в ходе измерения). Зависимости s, ,  или D от длины волны света называют спектрами поглощения вещества.