9 СоВременные методики эколого-микробиологических исследований окружающей среды

Исследования окружающей среды и продуктов питания должны осуществляться в строгой последовательности, что подробно представлено на таблицах 7–11 приложения.

Санитарно-экологические нормативы исследования воды централизованного водоснабжения (по СанПиН 2.1.4.1074–01).

Определение ОМЧ аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Метод основан на определении общего микробного числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 часов.

Методика проведения анализа

Из каждой исследуемой пробы делают высев не менее двух объемов по 1,0 мл в стерильные чашки Петри. После внесения пробы в каждую чашку вливают по 8,0–10,0 мл расплавленного и остуженного до 45–49 °С питательного агара и перемешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая при этом образования пузырьков. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при 37±1 °С в течение 24 часов.

При учете посевов предыдущего дня подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые в объектив с увеличением в два раза; количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл исследуемой пробы.

Эколого-бактериологический анализ питьевой воды (по МУК 4.2.1018–01).

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров.

Метод основан на фильтровании установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической питательной среде с лактозой и последующей идентификацией культур из выросших колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Пробу исследуемой воды разбивают на три объема по 100,0 мл и фильтруют.

Затем фильтры помещают на среду Эндо в чашки Петри, которые ставят в термостат дном вверх и инкубируют при 37°С и при 44,5 °С в течение 24 часов.

Анализ заканчивается через 24 часа.

Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, то дают отрицательный ответ: отсутствие общих колиформных бактерий (ОКБ) и тсрмотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) в 100,0 мл исследуемой воды.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозопозитивных колоний темно-красных или красных с металлическим блеском или без него, или других подобного рода колоний, то подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

С этой целью каждую колонию исследуют на:

— морфологию клеток и их отношение к окраске по Граму;

— наличие оксидазной активности;

— способность к ферментации глюкозы, лактозы до кислоты и газа при 37 °С.

Как ОКБ учитываются грамотрицательные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации глюкозы, лактозы с образованием кислоты и газа.

Как ТКБ учитываются грамотрицательные палочки при отрицательном оксидазном тесте и ферментации глюкозы и лактозы при 44,5 °С с образованием кислоты и газа.

При отсутствии общих колиформных бактерий и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают как «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100,0 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100,0 мл».

В случаях идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа в 100,0мл воды, вычисляя его по формуле:

Х = (а × 100) / V, где Х — число колоний в 100,0 мл; а — число подсчитанных колоний; V — объем воды профильтрованный через фильтр.

Например, при посеве 3 фильтров по 100,0 мл выросло две колонии в 100,0 мл, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет определяться таким образом: (2 × 100) / 300 = 0,7 КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100,0 мл воды.

Определение общих термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Титрационный метод может быть использован в следующих случаях:

— при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранных фильтров;

— при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

— при наличии в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Титрационный метод основан на накоплении бактерий при посеве установленного (определенного) объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на среду Эндо.

Учет результатов анализа (рост колоний) проводится после инкубации посевов на среде Эндо при 38 ± 1 °С в течение 18–20 часов.

Если нет роста, то посевы оставляют в термостате и повторно просматривают через 48 часов.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темно-красных, красных с металлическим блеском, вьпуклых с красным центром), дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме среды.

Для определения наличия термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) делают посев 2–3 изолированных типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металлическим блеском) в пробирки, содержащих среду с лактозой, предварительно прогретую до 44 °С.

После засева пробирки инкубируют при 44 ± 0,5 °С в течение 24 часов,

хотя уже через 4–6 часов допускается первичный учет результатов роста бактерий образования кислоты и газа.

При выявлении кислотообразования и газообразования у выделенных культур бактерий выдают положительный ответ о наличии в исследуемом объеме воды термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ).

При отсутствии кислоты и газа при учете (просмотре) посевов инкубацию проводят в течение еще 24 часов при 44 °С и выдают окончательный ответ.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий (Clostridium)

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие облигатно анаэробные палочковидные микроорганизмы из рода Clostridium, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 ± 1 °С в течение 16–18 часов.

Метод определения содержания сульфитредуцирующих клостридий основан на выращивании посевов из анализируемых проб воды на железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа выросших колоний.

Методика определения сульфитредуцирующих клостридий методом фильтрования в чашках Петри

Исследуемую пробу воды (20,0 мл) для исключения возможности развития вегетативных форм бактерий прогревают при 75 °С в течение 15 минут в пробирке на водяной бане.

Прогретую пробу фильтруют через мембранный фильтр, который затем помещают на железосульфитный агар (чашки Петри залиты питательной средой тонким слоем) фильтрующей поверхностью вниз, так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем всю поверхность среды с фильтром заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий.

Посевы культивируют при 44 ± 1 °С в течение 16–18 часов, хотя окончательный результат получают через 24 часа и выражают его числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих бактерий в 20,0 мл воды.

Если не отмечен рост черных колоний на всех фильтрах, то в протоколе анализа дают ответ «не обнаружено в 20,0 мл воды».

При наличии черных колоний на всех фильтрах их подсчитывают, и результат анализа вычисляют по формуле:

Х = (а × 20) / V, где Х — число клостридий в 20,0 мл; а — число подсчитанных колоний; V — профильтрованный объем воды.

Определение колифагов

Колифаги — бактериофаги (вирусы), способные лизировать Е. соli и формировать на питательном агаре при 37 °С через 18–24 часа зоны лизиса бактериального газона (бляшки).

Титрационный метод определения колифагов

Метод основан на определении колифагов в пробах питьевой воды путем предварительного накопления их в среде обогащения на культуре Е. соli. последующем выявлении зон лизиса газона на питательном агаре.

Титрационный метод определения колифагов предназначен для проведения текущего анализа питьевой воды.

Методика проведения количественного анализа

В исследуемую пробу воды объемом 100,0 мл вносят 10,0 мл 10-кратного разведения питательного бульона и 1,0 мл смыва тест-культуры с плотной питательной среды или 2–4-х часовой бульонной культуры.

Для контроля культуры 0,1 мл смыва Е. соli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Исследуемую пробу воды (100,0 мл) и чашку Петри с контролем помещают в термостат и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 18 ± 2 часа, после чего из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10,0 мл и добавляют 1,0 мл хлороформа. Пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают для равномерного распространения хлороформа по объему пробы оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа (не менее 15 минут).

В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С питательный агар добавляют смыв бактерий Е. соli (из расчета 1,о мл на 100,0 мл агара) и перемешивают.

В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1,0 мл обработанной хлороформом пробы воды и заливают смесью расплавленного до 45–49 °С питательного агара объемом 12,0–15,0 мл и осторожно перемешивают.

Аналогичным образом готовят также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. соli.

Обе чашки помещают в термостат при 37 °С на 18–24 часа, после чего в проходящем свете осуществляют просмотр посевов.

Проба считается положительной, если «колифаги обнаружены в 100,0 мл воды» при наличии лизиса на чашке с пробой воды и при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

При наличии зон лизиса в контроле культуры результат анализа считается недействительным и выдается отрицательный ответ («колифаги не обнаружены в 100,0 мл воды»).

Прямой метод определения колифагов

Данный метод основан на определении колифагов в нормируемом объеме питьевой воды (100,0 мл) путем прямого посева пробы воды и последующего учета зон лизиса (бляшек, негативных колоний) на культуре Е. coli, посеянной методом газона, на чашки Петри с питательным агаром.

Прямой метод проводят при исследовании по эпидемическим показаниям.

Методика проведения количественного анализа

В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С питательный агар двойной концентрации добавляют смыв бактерий Е. соli (из расчета 2,0 мл на каждые 100,0 мл агара) и перемешивают.

Исследуемую пробу воды 100,0 мл разливают по 20,0 мл в пробирки, нагревают до 35–44 °С и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку вносят по 20,0 мл смеси агара с культурой E. соli.

Для контроля культуры Е. соli в одну чашку Петри вносят 20,0 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 35–44 °С, заливают 20,0 мл приготовленного агара с Е. соli, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 18–24 часов, после чего н проходящем свете осуществляют просмотр посевов.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек (зоны лизиса), появившихся на 5-ти чашках.

В контрольной чашке бляшки (зоны лизиса) должны отсутствовать.

При высоких концентрациях фагов наблюдается разная картина лизиса. Слияние негативных колоний (зон лизиса) дает «ажурный газон» Е. coli: рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса либо полное отсутствие роста на чашке.

Предварительный учет результатов можно проводить через 5–6 часов инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18–24 часа. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 10,0 мл пробы воды.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным

прямого посева может быть выдан окончательный ответ «колифаги обнаружены в 100,0 мл воды».

При получении отрицательного результата при работе прямым методом окончательный ответ выдается по результатам титрационного метода.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

Эколого-микробиологическое исследование почвы

Микробиологическое исследование почвенных образцов осуществляют согласно общепринятой методике по ГОСТ 17.4402–84.

Определение перфрингенс-титра почвы

Определение перфрингенс-титра как показателя содержания в почве облигатных анаэробов рода Clostridium (C. perfringens) является важным критерием для экологической оценки почвы и оценки процессов ее самоочищения.

Методика проведения анализа

Основную почвенную суспензию титруют путем 10-кратньих разведений.

Затем из каждого разведения берут по 1,о мл и заливают в пробирки с молоком, разлитым по 5,0 мл.

Посевы прогревают на водяной бане при 80 °С в течение 15 минут.

Наличие бактерий C. perfringens регистрируется по наступившему характерному свертыванию молока с полным отделением сыворотки и образованию губчатого сгустка на поверхности благодаря газообразованию.

Титром C. perfringens (верфрингенс-титр) считают предельное разведение почненной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний C. perfringens.

Определение титра нитрифицирующих бактерий

Появление и увеличение содержания нитрифицирующих бактерий в почве указывает на развитие процессов ее самоочищения.

Методика проведения анализа

Готовят 10-кратные разведения почвенной суспензии (от 1:100 до 1:10⁴) и затем производят посев во флаконы с жидкой синтетической средой Виноградского. В качестве контроля используют два флакона с незасеянной средой Виноградского. Посевы и контрольные флаконы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14–15-ти суток.

Уже на 5–7-е сутки культивирования с помощью качественной пробы с дифениламином проверяют образование азотистой или азотной кислоты.

Для этого к капле среды, помещенной на стеклянную пластинку, добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте — появление синего окрашивания указывает на присутствие нитратов. В контрольной среде изменения окраски не происходит.

Для более полной оценки процесса самоочищения почвы можно также определять группы микроорганизмов, быстро разлагающих органический субстрат: бациллы, актиномицеты, грибы.

На свежее фекальное загрязнение почвы указывают:

1) обнаружение энтерококков;

2) большое количество БГКП при отсутствии нитрифицирующих бактерий и термофилов;

3) относительно высокое содержание вегетативных форм клостридий.

Загрязнение почвы навозом, компостом или сточными водами и стадию разложения их органического субстрата помогает оценить определение термофильных бактерий.

Эколого-микробиологическое исследование пищевых продуктов (по ГОСТ 50474–93)

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, в том числе на продукты детского лечебного питания, мясо, включая мясо птицы, субпродукты и мясные продукты, рыбу, молоко и молочные продукты, маргарин, майонез, свежие и свежезамороженные овощи, картофель и т.д.

Определение бактерий группы кишечных палочек (БГкп)

К бактериям группы кишечных палочек (БГКП) относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при температуре 37–44 °С в течение 24–48 часов, в основном являющиеся представителями следующих родов: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia.

Методика проведения анализа

Посев пробы продукта проводят в среду Кесслера с лактозой и поплавками с соблюдением соотношения продукта и среды 1:10 и инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 часов.

При отсутствии признаков роста (газообразование или помутнение среды Кесслера) дают заключение об отсутствии БГКП в данной пробе продукта.

При наличии признаков роста из подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или Левина. При этом посев выполняют петлей из каждой колбы или пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний — на отдельный сектор, а лучше — на отдельную чашку.

Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–24 часов.

Учет результатов анализа

При отсутствии на среде Эндо и Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дающих на среде Эндо крупные с металлическим блеском или без него, розовые или бледно-розовые колонии, на среде Левина – черные с металлическим блеском, темные с черным центром, сиреневые с черным центром, засеянная навеска продукта считается незагрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо и Левина типичных или подозрительных для кишечной палочки (колиформных бактерий) колоний продолжают их изучение.

Для этого из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают мазки, окрашивают их по Граму и на наличие спор и микроскопируют.

Обнаружение в мазке грамотрицательных палочек, не содержащих спор, указывает на наличие БГКП в анализируемой массе продукта и его несоответствие микробиологическому нормативу.

Исследуемый продукт считается соответствующим нормативу на БГКП при подтверждении принадлежности подозрительных колоний к роду Erwinia и отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКГI.

Для определения принадлежности к роду Erwinia типичные для БГКП колония, выросшие на среде Эндо или Левина пересевают на питательный агар с 5 %-ной сахарозой, на котором бактерии рода Erwinia дают выраженный мукоидный рост, не свойственный колиформным бактериям.

Определение энтерококков

Определение энтерококков проводят в случае обнаружения в партии продуктов значительного превышения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Методика проведения анализа

По 0,1 см³ жидкого продукта засевают на поверхность молочной среды с полимиксином в 2 чашки Петри и инкубируют при 37 °С в течение 48 часов.

При учете результатов на обеих чашках подсчитывают количество только типичных колоний энтерококков — красного цвета с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды. При этом среднеарифметическое число колоний умножают на 10 или 100, получая количество энтерококков в 1,0 г или 1,0 м³ продукта.

Одновременно 3–5 типичных колоний отсевают на скошенный мясопептонный агар для накопления чистой культуры с целью дальнейшей идентификации. После инкубации при 37 °С в течение 24 часов из исследуемой культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Кроме этого, определяют каталазную активность исследуемой культуры, поскольку энтерококки перекись водорода не разлагают. Для этого культуру помещают на чистое обезжиренное предметное стекло, добавляют 1 %-ный раствор перекиси водорода, смешивают. Если при смешивании пузырьки газа не выделяются, реакция отрицательна.

Известно, что энтерококки способны к росту на средах с высоким содержанием желчи, поэтому исследуемую культуру также засевают в бульон, содержащий 40 % желчь, и инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов.

Возможный рост изучаемых культур в посевах на жидкой среде обязательно подтверждают микроскопией мазка и постановкой теста на каталазу.

Обнаружение значительного роста энтерококка при посеве исследуемого материала свидетельствует о необходимости контроля за данным продуктом.

Определение количества дрожжей и плесневых грибов

Метод основан на количественном подсчете колоний дрожжей плесневых грибов, вырастающих на специальных плотных питательных средах с антибиотиками при температуре 24 °С в течение 5 суток после посева исследуемого материала.

Методика проведения анализа

Из каждой пробы делают высев по 1,0 см³ продукта или по 1,0 см³ разведений продукта 1:10 и 1:100 на две чашки Петри со средой Сабуро.

Через 15–20 минут в каждую чашку добавляют по 14,0 см³ одной из агаризованных сред, охлажденных до 45–49 °С и антибиотики. После тщательного перемешивания среды, избегая при этом образования пузырьков и застывания агара, чашки с посевами помешают в термостат вверх дном и инкубируют при 24 °С в течение 5 суток (120 часов) с предварительным учетом роста через 3 дня.

При учете посевов проводят подсчет соответствующих колоний на каждой чашке отдельно.

При этом колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально, при необходимости проводят микроскопическое исследование.

Типичные колонии плесневых грибов имеют поверхность, покрытую пушистым мицелием, похожим на вату.

Рост дрожжей сопровождается образованием крупных выпуклых блестящих серовато-белых или беловато-желтых колоний с гладкой поверхностью, ровным краем, сметанообразной консистенцией. Кроме того, по мере роста и увеличения размеров колонии дрожжей могут приобретать перламутровый оттенок и куполообразное возвышение.

Для количественного учета результатов посевов путем подсчета выросших колоний (КОЕ) отбирают те чашки, на которых выросло от 5-ти до

50-ти колоний дрожжей и (или) от 5-ти до 50-ти колоний плесневых грибов.

Метод выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes

Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую селективную питательную среду (с предварительным обогащением, последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и культивировании посевов при оптимальных условиях. Принадлежность выделенных колоний к L. monocytogenes определяют по биохимическим и антигенным свойствам.

Отбор и подготовка проб для анализа

Масса или объем навески должны составлять 25,0 ± 0,1 г (см³) для мясных продуктов и 50,0–100,0 г (см³) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания.

Методика проведения анализа

Соотношение между количеством продукта детского, лечебного питания и питательной средой должно составлять 1:9, поэтому навеску исследуемого пищевого продукта массой 25,0 ± 0,1 г или объемом 25,0 ± 0,1 см³ вносят в 225,0 см³ (225,0 мл) жидкой среды для предварительного обогащения.

Посевы инкубируют при температуре 30–31 °С в течение 24–26 часов, затем навеску засевают на бульон Фразера, содержащий эскулин, в соотношении 1:9.

При росте листерий на бульоне Фразера отмечается почернение среды, в то время как на питательной среде без эскулина почернения не происходит.

После инкубирования продукта на бульоне Фразера содержимое среды независимо от наличия в нем изменений в количестве 1,0 см³ пересевают в 10,0 см³ одной из сред обогащения и вновь посевы инкубируют при температуре 37–38 °С в течение 48 часов.

После этого при отсутствии роста характерных для листерий колоний на селективно-диагностических средах дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в исследуемой пробе продукта.

При обнаружении роста листерий, сопровождающегося почернением колоний и среды, по комплексу других биологических свойств определяют принадлежность колоний к бактериям данного рода. С этой целью, используя стандартные методики, определяют:

— отношение к окраске по Граму;

— наличие или отсутствие капсул и спор;

— подвижность бактерий при температуре 22–23 °С и 37–38 °С;

— каталазную активность;

— нитратредуцирующие свойства.

К бактериям рода L. monocytogenes выделенные микроорганизмы могут быть отнесены, если они — грамположительные короткие тонкие палочки, не образующие спор и капсул, подвижны при температуре 22–23 °С, каталазопозитивны, не восстанавливают нитраты в нитриты.

Дальнейшую идентификацию до вида L. monocytogenes проводят общепринятыми методами, используя постановку реакции агглютинации по идентификации с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой.

Положительным результат анализа продукта на содержание L. monocytogenes считается, если из среды накопления выделены грамположительные короткие тонкие неспорообразующие палочки, капсулы не имеют, подвижны при температуре 22–23 °С, неподвижны при 37–38 °С, каталазоположительны, гидролизующие эскулин, ферментируюшие с образованием кислоты рамнозу и мальтозу, не сбраживающие маннит и ксилозу, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию агглютинации по идентификации с соответствующей агглютинирующей сывороткой.

Определение бактерий из рода Proteus

Сущность метода заключается в определении у выделенной культуры морфологических свойств, характера роста, способности гидролизовать мочевину и образовывать сероводород.

Методика проведения анализа

0,5 мл анализируемой взвеси бактерий (из предварительно выделенной чистой культуры) вносят в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара, разлитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича).

Через 18–24 часа инкубации при температуре 37 °С основное внимание уделяют возможному образованию ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком на поверхности скошенного агара и подъему культуры из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды.

При наличии такого роста, характерного для протеев, культуру бактерий микроскопируют, изучают ее подвижность в препарате «висячая капля» и биохимические свойства стандартными методами.

Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, дающих ползучий рост вследствие высокой подвижности, ферментирующих глюкозу и мочевину и не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий рода Proteus.

Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при 30 °С в течение 72 часов.

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний.

Из каждой пробы делают высев на 2–3 чашки, причем каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1,0 см³ в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой в залито 10,0–15,0 см³ расплавленной и охлажденной до температуры 40–45 °С питательной среды для определения общего количества бактерий. Допускается посев исследуемого продукта на чашки Петри из одного и того же разведения в количестве 1,0 см³ и 0,1 см³.

Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат при температуре 30 °С на 72 часа.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, и пользуясь лупой с увеличением в 4–10 раз.

При большом числе колоний дно чашки делят на 4 и более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний на 2–3-х секторах, находят среднее арифметическое и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом находят общее количество колоний, выросших на одной чашке и вычисляют общее количество бактерий в 1,0 см³ или 1,0 г продукта по следующей справке:

X = n × 10^m, где n — число колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m — число десятикратных разведений.

Молоко и молочные продукты

При исследовании санитарно-экологического качества молока и продуктов из него пользуются методами микробиологического анализа (по ГОСТ 9225–84), а также методами определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий (по ГОСТ 25102–90).

Определение спор мезофильных анаэробных бактерий

Для определения общего количества спор мезофилыиых анаэробных бактерий в молоке и сырах производят посев 1,0 см³ исследуемого образца (для молока — из нулевого, первого и второго, а для сыров — первого и второго разведения) в пробирку с 10 ± 2,0 см³ специальной питательной среды, предварительно выдержанной перед анализом в кипящей водяной бане в течение 30 минут и охлажденной.

При этом каждый образец выбранных разведений исследуемого молока и сыра засевают в 2 пробирки с питательной средой, внося посевной материал на дно пробирки, не допуская взбалтывания и заливая сразу после посева пробирки слоем предварительно расплавленного и охлажденного до 45 °С водного агара, высота которого должна быть не менее 20,0 ± 5,0 мм.

Посевы инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 72 часов.

Наличие спор мезофильных анаэробных бактерий в засеянных объемах исследуемого образца молока или сыр определяют по появлению разрывов агарового столбика, образуемых в результате газообразования при росте этих бактерий.

Наиболее вероятное число спор мезофильных анаэробных бактерий при анализе сыра определяют по числу пробирок, в которых они дали рост с посевом 0,1 см³ и 0,01 см³ (Приложение, табл. 13).

Методы анализа качества продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов (по СанПиН 42–123–4940–88)

Определение Еscherichia соli в продуктах детского питания

Бактерии вида Е. соli, входящие в группу колиформных бактерий, являющиеся индикатором относительно свежего фекального загрязнения, представляют собой грамотрицательные, неспорообразующие палочки, не утилизирующие цитрат, способные расти и ферментировать лактозу при температуре выше температуры тела (от 44 до 45,5 °С).

Метод основан на выявлении способности кишечной палочки фементировать лаквiозу с образованием кислоты и газа при температуре 44 °С от 24 до 48 часов. Идентификацию Е. coli проводят по следующим таксономическим признакам: образование индола, положительная реакция с красным метилом, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра и отсутствие способности утилизировать цитрат.

Методика проведения анализа с предварительной инкубацией

Асептически взвешивают 10,0 г сухого детского продукта «Детолакт», растворяют в колбе в 90,0 см³ разбавленного фосфатного буфера; рН доводят до 7,0, для чего используют пастеризованный 1н раствор гидроокиси натрия или 1н раствор соляной кислоты, проверяя рН индикаторной бумажкой.

Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение 24 часов.

1,0 см³ смеси из этой колбы засевают в пробирку или колбу с 9,0 см³ среды Кесслера с лактозой и поплавком и инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 часов.

При отсутствии газа, помутнения, изменения цвета среды в посевах продуктов, подвергавшихся предварительной инкубации, результат анализа считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в нем Е. coli, т.е. соответствии продукта нормативу по этому показателю.

Методика проведения анализа без предварительной инкубации

Навеску продукта 10,0 г (см³) помещают в колбу с 90,о см³ среды Кесслера с лактозой и поплавком и инкубируют при 44 °С 24 часа.

При отсутствии признаков роста (газообразование и помутнение среды) посевы инкубируют еще 24 часа.

При отсутствии газа и других признаков роста в посевах дают заключение об отсутствии в продукте Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю.

Пробирки (колбы), в которых обнаружен газ или другие признаки роста, подвергают дальнейшему изучению, для чего производят посев штрихом или рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы получить изолированные колонии. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

При просмотре посевов необходимо учитывать, что эшерихии на среде Эндо дают красные с металлическим блеском или без него розовые колонии; на агаре Левина – черные, темно-коричневые с темным центром, с металлическим блеском или без него.

Если из окрашенных колоний при микроскопии мазков окрашенных по Граму и на наличие спор, обнаруживаются грамотрицательные неспорообразующие палочки, то все типичные колонии подвергаются идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата).

При учете результатов в первую очередь обращают внимание на наличие роста и/или изменение цвета среды Симмонса, содержащей цитрат, с зеленого на синий или желтый, что характерно для цитрат-положительных культур. Для цитрат-отрицательных разновидностей бактерий характерно отсутствие роста и изменения цвета среды.

При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ на лактозе при температуре 44 °С, образующих или не образующих индол, дающих положительную реакцию с метиловым красным, отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и не растущих на среде Симмонса (Козера), считают, что в 10,0 г продукта содержится E. coli.

Продукт в данном случае бракуется. При обнаружении в 10,0 г продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии колиморфных бактерий в 1,0 г продукт браковке не подлежит.

Определение сальмонелл (бактерий рода Salmonella) в пищевых продуктах

Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделении на специальных агаровых средах, идентификации с использованием биохимических и серологических методов.

Для посева используют то количество продукта, в котором регламентируется отсутствие бактерий рода Salmonella. Перед посевом проводят инкубацию продукта в фосфатном буферном растворе.

Компоненты детских сухих молочных продуктов засевают без предварительной инкубации, непосредственно в колбу со средой для селективного обогащения.

Посев с предварительной инкубацией

Продукт взвешивают в стерильных условиях в стакане и затем для предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу разбавленным фосфатным буфером. Соотношение массы продукта буферного раствора 1:10, рН доводят до 7,0 ± 0,2 1н раствором гидроокиси натрия, перемешивают и встряхивают.

К приготовленной таким образом взвеси продукта добавляют 0,1 %-ный водный раствор бриллиантового зеленого в количестве 2 % к объему (т.е. 20,0 см³ раствора красителя к 1000,0 см³ взвеси продукта), перемешивают и выдерживают в термостате при температуре 37 °С от 18 до 24 часов.

На следующий день 1,0 см³ выдержанной в термостате смеси переносят пробирки с 10,0 см³ магниевой среды или среды Мюллера и инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–24 часов.

Прямой посев в среды для селективного обогащения

Асептически сделанные навески сухих компонентов продукта засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды 1:9.

Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиента при соотношении продукта и среды 1:1.

В обоих случаях колбы с посевами инкубируют в течение 18–24 часов при 37 °С, после чего производят высев на поверхность чашек с подсушенными дифференциально-диагностическими средами — Плоскирева и висмут-сульфит агара. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов, причем просмотр посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 часов после инкубации.

При наличии смешанного роста необходимо сделать повторный пересев на питательный агар для выделения чистых культур и получения изолированных колоний.

Типичные колонии сальмонелл бывают:

— на среде Плоскирева — бесцаетные, прозрачные, плоские;

— на висмут-сульфитном агаре — черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком, при этом наблюдается окрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред результат анализа считают «отрицательным», т.е. в исследуемой массе продукта сальмонелл нет.

При наличии на чашках Петри типичных для сальмонелл колоний или колоний, подозрительных на сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение.

Для этого выбирают хорошо изолированную колонию и засевают на пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной или средой Клиглера и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

Идентификацкю выделенных культур проводят, соответственно, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины:

— покраснение или пожелтение скошенной части столбика трехсахарной среды (при посеве уколом) говорит об образовании кислоты в результате ферментации лактозы или сахарозы;

— покраснение столбика трехсахарной среды указывает на расщепление глюкозы;

— бледно-розовый цвет столбика трехсахарной среды указывает на расщепление мочевины;

— об образовании сероводорода судят по почернению в столбике трехсахарной среды.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, то они не принадлежат к бактериям рода Salmonella, поэтому дальнейшему изучению подвергаются культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа).

Прямой посев в среды для селективного обогащения

Асептически сделанные навески сухих компонентов продукта засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды 1:9.

Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиента при соотношении продукта и среды 1:1.

В обоих случаях колбы с посевами инкубируют в течение 18–24 часов при 37 °С, после чего производят высев на поверхность чашек с подсушенными дифференциально-диагностическими средами — Плоскирева и висмут-сульфит агара. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 24–48 часов, причем просмотр посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 часов после инкубации.

При наличии смешанного роста необходимо сделать повторный пересев на питательный агар для выделения чистых культур и получения изолированных колоний.

Типичные колонии сальмонелл:

— на среде Плоскирева — бесцветные, прозрачные, плоские;

— на висмут-сульфитном агаре — черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком, при этом наблюдается окрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл каждой из сред результат анализа считают «отрицательным», т.е. в исследуемой массе продукта сальмонелл нет.

При наличии на чашках Петри типичных для сальмонелл колоний или колоний, подозрительных па сальмонелл, производят их дальнейшее изучение.

Для этого выбирают хорошо изолированную колонию и засевают на пробирки с трехсахарным агаром с мочевиной или средой Клиглера и инкубируют при 37 С в течение 24 часов.

Идентификацию выделенных культур проводят, соответственно, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины:

— покраснение или пожелтение скошенной части столбика трехсахарной среды (при посеве уколом) говорит об образовании кислоты в результате ферментации лактозы или сахарозы;

— покраснение столбика трехсахарной среды указывает на расщепление глюкозы;

— бледно-розовый цвет столбика трехсахарной среды указывает на расщепление мочевины;

— об образовании сероводорода судят по почернению в столбике трехсахарной среды.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, то они не принадлежат к бактериям сальмонелл поэтому дальнейшему изучению подвергаются культуры, не ферментирующие лактозу и нё расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа).

Культуры, ферментирующие глюкозу без образования газа, подозрительных как брюшнотифозные сальмонеллы или дизентерийные бактерии.

Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа, т.е. дающие в среде пузырьки, и продуцирующие сероводород, могут принадлежать к роду сальмонелл.

Если во всех пробирках отсутствует характерная для сальмонелл реакция, результат считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта бактерий рода сальмонелл.

Если обе пробирки покажут типичную для сальмонелл реакцию, а выделенный штамм дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, то в этом случае проводят серологическую идентификацию с помощью реакции агглютинации по идентификации с сальмонеллезными О-сыворотками. Если реакция агглютинации по идентификации отрицательная (агглютинации не наблюдается в течение 30–60 секунд), то конечный результат анализа записывают как отрицательный.

При выделении культур грамотрицательных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не образующих сероводород, дающих отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и положительную реакцию агглютинации по идентификации с соответстнующими сальмонеллезными О-сыворотками, считают, что в исследуемой навеске продукта присутствуют бактерии рода сальмонелл, и продукт к реализации не допускается.

Определение коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus) (по СанПиН 42–123–4940–88)

Метод основан на способности микроскопических организмов рода Staphylococcus расти в средах с повышенным содержанием хлорида натрия (6,5 %).

При этом наибольшее экологическое значение имеет обнаружение среди всех представителей данного рода и вида коагулазоположительных S. aureus — способных коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

Методика проведения анализа

Навеска продукта должна составлять:

— 10,0 г — без предварительной термической обработки;

— 1,0 г — с предварительной термической обработкой.

Сухие молочные продукты типа «Детолакт», «Новолакт ММ», «Новолакт-1», восстанавливаемые перед употреблением при 37 °С и 70 °С, перед посевом подвергаются разведению в фосфатном буферном растворе.

В стерильных условиях взвешивают 10,0 г или, соответственно, 1,0 г продукта и помещают в колбы с 90,0 см³ или, соответственно, 9,0 см³ разбавленного фосфатного буфера, тщательно перемешивают.

Полученную смесь инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов, затем 1,0 см³ этой смеси переносят в пробирку с соленым бульоном (6,5 % натрия хлорида) и снова инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

Жидкие, пастообразующие и другие продукты, не подвергающиеся предварительной инкубации, в количестве 1,0 г или 10,0 г засевают в пробирки или колбы с соленым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов.

В обоих случаях для выделения чистой культуры стафилококков делают пересев петлей из соленого бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер или желточно-солевой агар (ЖСА) и снова инкубируют при 37 °С в течение 18–24 часов.

Учет роста колоний:

— на среде Байрд-Паркер S. aureus растет в виде черных, блестящих, выпуклых колоний. При этом штаммы золотистого стафилококка, выделенные из пищевых продуктов и штаммы, продуцирующие энтеротоксин, на этой среде часто дают просветление через 24 часа инкубации при 37 °С.

— на желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии стафилококка имеют форму выпуклых дисков белого, желтого, кремового, лимонного цвета с ровным краем, окруженные зоной лецитиназной активности.

Из подозрительных на стафилококк колоний в любом случае готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

При обнаружении грамположительных кокков, расположенных в виде скоплений, делают пересев на скошенный агар (МПА с 0,1 % глюкозой) для накопления чистой культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

Выделенную чистую культуру пересевают на среду Гисса с маннитом или мальтозой, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом) и снова инкубируют при 37 °С в течение 24 часов.

В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.

Выделенную чистую культуру также обязательно исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5–1,0 см³ цитратной плазмы крови кролика вносят одну петлю суточной агаровой культуры бактерий. Еще одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при 37 °С в течение 24 часов. Результат реакции при этом учитывают через 2, 4, 6 и 24 часа.

При учете реакции плазмокоагуляции возможно 2 варианта:

— реакция плазмокоагуляции считается положительной при образовании даже небольшого сгустка плазмы через 24 часа культивирования, соответственно, исследуемую культуру относят к коагулазоположительным, что в свою очередь свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в 10,0 г или, соответственно, 1,0 г (см³) продукта.

— реакция плазмокоагуляции считается отрицательной, если свертывание плазмы не происходит через 24 часа культивирования, исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательным.

Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительного стафилококка в засеянной массе.

При значительном росте коагулазоотрицательных стафилококков в посевах детских сухих молочных смесей необходимо обратить внимание на соблюдение санитарно-экологических норм их изготовления, т.к. у детей грудного возраста некоторые коагулазоотрицательные стафилококки способны вызывать острые энтериты.

Определение бактерий Васillиs cereus

В. cereus — аэробные спорообразующие грамположительные палочки, некоторые штаммы которых способны продуцировать энтеротоксин.

В продуктах, выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост В. cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю по этому микроорганизму — менее 10 клеток на грамм.

При несоответствии нормативу только по В. cereus в сухих молочных продуктах типа «Детолакт» (в отдельных случаях от 100 до 200 КОЕ/г) партия однократно не задерживается для реализации, В таких случаях проводят исследование на наличие В. cereus в компонентах растительного и животного происхождения. В случае обнаружения значительного количества бактерий дают рекомендации о возможности использования их в производстве.

Метод основан на выявлении и количественном подсчете колоний бактерий вида В. cereus, относящихся к спорообразующим бациллам, при росте их на специальных плотных питательных средах.

Методика проведения анализа

Производят посев по 0,1 см³ (0,01 г) и по 0,2 см³ (0,02 г) сухих молочных продуктов из разведения 1:10 на поверхность хорошо подсушенной плотной специальной питательной среды доiована, разлитой в чашки Петри.

Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24–96 часов.

При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу по этому показателю.

При обнаружении роста на среде Донована изучают выросшие колонии, учитывал при этом, что В. cereus на среде Донована образуют крупные белые распластанные колонии с изрезанными краями, окруженные зоной глубокого белого матового коагулята или зоной просветления результат проявления лецитиназной активности.

Из изучаемых колоний делают мазки, окрашивают по Граму и на наличие спор, затем микроскопируют, учитывая, что В. cereus грамположительные спорообразующие палочки.

Для накопления чистых культур 3–5 колоний пересевают на скошенный агар с последующей инкубацией при 30 °С в течение 24–48 часов.

У выделенных чистых культур методом «висячей капли» определяют подвижность. Кроме этого, эти культуры засевают: на кровяной агар; на среду с маннитом; на среду Кларка для постановки реакции Фогес-Проскауэра (в пробирки).

Посевы инкубируют при 30 °С в течение 24–48 часов.

Характерными признаками для бактерий вида В. cereus являются: наличие подвижности; положительная проба на лецитиназу; гемолитическая активность (образование зон просветления вокруг колоний) на кровяном агаре; отсутствие способности ферментировать маннит; положительная реакция Фогес-Проскауэра.

Подсчет обнаруженных в продукте бактерий вида В. cereus проводят путем умножения количества типичных выросших на среде Донована колоний на соответствующее разведение, затем пересчитывают в расчете на 1,0 г или 1,0 см³ исследуемого продукта.

Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах

(по МУК 4.2.026–95)

Допустимое значение антибиотиков для продуктов не должно превышать для тетрациклина 0,01 ЕД, пенициллина — 0,01 ЕД, стрептомицина 0,5 ЕД на 1,0 г (мл) продукта.

Метод качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основан на подавлении антибиотиками дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, то клетки тест-культур теряют способность восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях, поскольку метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора.

Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4–5 часов, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.

Методика проведения анализа состоит из нескольких этапов:

1. Подготовка проб к исследованию при качественном и. количественном определении.

2. Получение и хранение взвеси из клеток тест-культур.

3. Определение рабочей дозы» тест-культуры.

4. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе.

5. Качественное определение антибиотиков.

Подготовка проб к исследованию при качественном определении

Молоко (по ГОСТ 13928–84).

Сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения; до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре 4 ± 1 °С. Пробу в объеме не менее 10,0 см³ переносят в пробирку.

Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока).

Непосредственно перед исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре не выше 45 ± 1 °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа объемом не менее 10,0 см³.

Мясо и субпродукты

Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевой сок в объеме не менее 10,0 см³ переносят в пробирку.

Термическая обработка проб пищевых продуктов

Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами помещают в водяную баню с температурой 60 ± 1 °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания — 30 минут — отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки.

Подготовка проб к исследованию при количественном определении.

Молоко, молочные продукты, яйца

Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, яйцах, пробы, подготовленные к исследованию в количестве 10,0 мл или 10,0 г (смешанного содержимого каждого яйца) вносят в колбы емкостью 50,0 мл и добавляют равное количество (10,0 мл) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: тетрапиклин цитратно-солянокислый (рН 5,8–6,0), стрептомицин – 0,066 М фосфатный буфер (рН 7,8–8,0), пенициллин — 0,066 М фосфатный буфер (рН 6,8–7,0). Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в два раза.

Мясо и мясные продукты

Навески по 10,0 г мышечной ткани, почек, печени, легкого и т.д., вырезанные из средней части образца, измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10,0 мл соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные пробирки.

Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 минут в термостате при 37 ± 1 °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при 65 ± 1 °С в течение 20 минут. Из надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1:2, берут 1,0 мл и прибавляют 1,0 мл соответствующего буфера, получают второе разведение 1:4 и т.д. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от каждого образца мяса и мясных продуктов.

Получение и хранение взвеси клеток тест-культур

Тест-культурами служат вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Ваcillиs subtilis вар. 6633, В. subtilis вар. L₂, В. micoides 537, Мiсrococcus luteum АТСС 9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.

Для определения тетрациклина предпочтительно пользоваться штаммом В. subtilis вар. L₂, а для пенициллина и стрептомицина – всеми остальными.

Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в столбике полужидкого (0,4 %) питательного агара.

Вначале тест-культуру рассевают на чашки с 2 % МПА для получения отдельных колоний и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 20–24 часов. После этого для накопления чистой культуры отсевают в пробирки с 2 % скошенным МПА и вновь инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 20–24 часов.

Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре 4 ± 1 °С не более 7 дней.

По дегидрогеназной активности жизнеспособных клеток тест-культуры в смыве определяют «рабочую дозу» тест-культуры, т.е. наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время (1 час) в термостате при температуре 37 °С.

Количественное определение концентрации антибиотика и расчет активности

При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. для этого навеску стандарта антибиотика 1,0 г растворяют в 1 1,0 мл соответствующего буфера, получал, таким образом, основной раствор стандарта 1000,0 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100,0 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду, разводят соответствующими буферными растворами.

Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5мл МПБ. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотика и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры.

После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную «рабочую дозу» тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, взывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 час. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует «рабочей дозе» тест-культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 3-х часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2,0 мл 1 % МПА с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при 37 °С в термостате.

Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культуры и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (цвет — синий).

О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 часа инкубации в термостате при температуре 37 °С, по сравнению с контролем.

Качественное определение антибиотиков

Подготовленные к использованию испытуемые пробы в объеме 0,5 мл вносят в пробирки с таким же количеством МПБ и тщательно перемешивают.

Во все пробирки добавляют 0,5мл взвеси, содержащей двойную рабочую дозу тест-культуры.

Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-х часовую экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом.

После этого в каждую пробирку вносят по 2,0 мл растопленного и охлажденного до 45 ± 1 °С МПА с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 1–2 часов.

Учет результатов

1. При отсутствии в пробах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-систем не нарушаются и восстанавливают (т.е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий.

2. В контрольной пробирке, где нет испытуемого образца, также происходит обесцвечивание в течение 1–2 часов наблюдения в термостате при 37 ± 1 °С (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест-культуры).

3. При наличии антибиотика в испытуемом образце дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается и цвет в пробирке не меняется, остается синим.

4. Параллельно в качестве второго контроля можно использовать субстраты, содержащие определенную концентрацию антибиотика.