Chastnaya_mikrobiologia

контроль чистоты выделенной культуры. Со среды Олькеницкого приготовлен мазок, окрашен его по Граму. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационные препараты сальмонелл – возбудителей тифо-паратифозных заболеваний (S.typhi, S.paratyphi, S.schottmuelleri, окраска по Граму), приготовленные из чистых культур. Сальмонеллы – грамотрицательные палочки с закругленными краями, идентичны по морфологическим свойствам;

идентификация выделенной культуры возбудителя:

-по антигенным свойствам – учесть ориентировочную реакцию агглютинации (ОРА) на предметном стекле со смесью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток, а также с отдельными О- (2, 4, 7, 9), Н- 1 фазы (a, b, c, d) и Н-2 фазы (1,2) сыворотками. Развернутая реакция агглютинации (демонстрация) ставится в пробирках с двукратными последовательными разведениями специфической агглютинирующей сыворотки от I:200 и выше до титра (титр указывается на ампуле с сывороткой) и выделенной культурой; в качестве контроля используется фи-

зиологический раствор. Во все пробирки вносят по 2 капли исследуемой культуры, выдерживают в термостате при 370 С в течение 2 часов, затем 18-20 часов при комнатной температуре, после чего производят учет.

-по биохимическим свойствам - определить биохимическую активность исследуемой культуры по пестрому ряду Гисса или Пешкова (демонстрация). Обратить внимание на расщепление глюкозы и отсутствие расщепления лактозы и сахарозы.

-по фаголизабельности - учесть пробу на фаголизабельность (демонстрация)

Определение фаговара выделенной культуры (демонстрация). Сделан посев выделенной

культуры "газоном" на чашку с МПА. На поверхность посева нанесено по 1 капле специфических типовых фагов. Фаговар определяют по наличию "стерильных" пятен на месте нанесения типового фага cooответствующего фаговару культуры через сутки инкубации в термостате при 370 С.

Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков (демонстрация).

2. Серологический метод диагностики тифо-паратифозных заболеваний.

Учесть демонстрационную реакцию агглютинации Видаля, поставленную с четырьмя диагностикумами (брюшнотифозными О и Н, паратифозными А и В ОН). Сыворотка крови больного титруется от 1:100 и выше. Диагностический титр - 1:200.

Учесть реакцию непрямой Vi-гемагглютинации (демонстрация). Реакция поставлена с сывороткой крови больного и зритроцитарным Vi -диагностикумом. Диагностический титр - 1:50 – I:100

3. Изучать биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики тифопаратифозных заболеваний:

-диагностикумы (взвеси убитых бактерий) для постановки реакции агглютинации (Видаля) брюшнотифозные О и Н, паратифозные А и В ОН с целью определения антител в крови больного;

-эритроцитарный Vi-диагностикум - взвесь эритроцитов, конъюгированных с Viантигеном S.typhi. Используется для постановки реакции непрямой Viгемагглютинации с целью и выявления бактерионосительства;

-сальмонеллезные групповые адсорбированные и монорецепторные О- и Н- агглю-

тинирующие сыворотки для определения антигенной структуры сальмонелл с помощью РА

-типовые сальмонеллезные бактериофаги для фаготипирования сальмонелл

-брюшнотифозные вакцины. На протяжении ряда лет для профилактики брюшного тифа используются убитые цельноклеточные брюшнотифозные вакцины, которые заменяют в нестоящее время живой оральной или полисахаридной вакцинами. Одна из них - ВИАНВАК, обогащенная хроматографически чистым полисахаридным Vi-антигеном, для профилактики брюшного тифа. Разработана также живая пероральная брюшнтифозная вакцина. Кроме того, в России зарегистрирована вакцина ТИФИМ Ви производства французской фирмы Авентис Пастер, приготовленная на основе полисахарида, выделенного из бактерий Salmonella typhi.

41

- поливалентный брюшнотифозный бактериофаг (таблетки с кислотоустойчивым по-

крытием) для экстренной профилактики брюшного тифа.

Педиатрические аспекты темы

1. Диагностический титр в реакции Видаля у детей 1:100. Положительная реакция Видаля у детей от 1 года до 14 лет регистрируется в 65 – 90% случаях в конце первой, начале второй недели заболевания.

Микробиологическая диагностика сальмонеллезов

Помимо сальмонелл – возбудителей брюшного тифа и паратифов А и В, описано более 2400 патогенных сероваров сальмонелл, вызывающих у человека острые гастроэнтериты, тифоподобные и септикопиемические формы заболевания, объединенных под названием сальмонеллез. Основными возбудителями сальмонеллеза являются Salmonella сероваров enteritidis, typhimurium, choleraesuis, haifa и т.д.

Бактериологический метод является ведущим методом в лабораторной диагностике сальмонеллеза (схема 10). Культуры сальмонелл чаще всего удается выделить из испражнений больных, несколько реже — из рвотных масс и промывных вод желудка, еще реже — из крови, мочи и желчи. Выделение сальмонелл из крови, костного мозга, спинномозговой жидкости, рвотных масс и промывных вод желудка подтверждает диагноз сальмонеллеза. У бактерионосителей сальмонеллы можно обнаружить в кале, моче, желчи.

Исследуемый материал засевают на чашки с висмут-сульфитным агаром и в среды накопления (магниевую, селенитовую), из которых через 6— 10 ч делают пересев на висмут-сульфит агар. Посевы выращивают при температуре 370 С, на второй день отбирают колонии черного цвета и пересевают на среду Олькеницкого (или Ресселя) для накопления чистой культуры. На 3-й день исследования выделенные чистые культуры пересевают в среды «пестрого» ряда и ставят РА с поливалентными и групповыми (А, В, С, Д, Е) адсорбированными сальмонеллезными сыворотками. Если получен положительный результат с одной из групп сывороток, проводят РА с адсорбированными О-сыворотками, характерными для данной группы, а затем с монорецепторными Н-сыворотками (неспецифической и специфической фазами) для определения серогруппы и серовара сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта.

На 4-й день исследования учитывают изменения сред «пестрого» ряда (табл. 10). Возбудители сальмонеллеза так же, как сальмонеллы паратифа В, не ферментируют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, маннит и мальтозу с образованием кислоты и газа, не образуют индола и (за небольшим исключением) выделяют сероводород.

Схема 10. Микробиологическая диагностика сальмонеллезов.

Материал для исследования: испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, моча и желчь, пунктат костного мозга, спинномозговая жидкость.

42

Бактериологический метод

1 день. Посев на ВСА и в среды накопления (магниевую, селенитовую). Пересев из сред накопления через 6— 10 ч на ВСА. Культивирование сутки при 370 С.

2 день. Пересев колоний черного цвета с ВСА на среду Олькеницкого (или Ресселя) для накопления чистой культуры.

3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого, проверка чистоты выделенной культуры, пересев выделенной чистой культуры в среды «пестрого» ряда, постановка ОРА с поливалентными и групповыми (А, В, С, Д, Е) адсорбированными сальмонеллезными сыворотками. При положительном результате с одной из групп сывороток, проводят РА с адсорбированными О-сыворотками, характерными для данной группы, а затем с монорецепторными Н-сыворотками (неспецифической и специфической фазами) для определения серогруппы и серовара сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта.

4-й день. Учет изменений в средах «пестрого» ряда. Формулировка ответа.

Серологический метод

Постановка РНГА с парными сыворотками крови больных, взятыми с интервалом в 7-10 дней и сальмонеллезными поливалентными и групповыми (групп А, В, С, Д, Е) диагностикумами с целью выявления антител.

Биопроба. Материалом от больного производят пероральное заражение белых мышей, которые через 1-2 дня погибают от септицемии. При посеве крови из сердца и материала из внутренних органов выделяется культура сальмонелл.

Серологическое исследование - исследование с помощью РНГА парных сывороток крови больных, взятых с интервалом в 7-10 дней с сальмонеллезными поливалентными и групповыми (группы А, В, С, Д, Е) диагностикумами. Диагностическое значение имеет повышение титра антител в четыре и более раз.

Самостоятельная работа студентов

Изучить основные этапы бактериологического исследования метода диагностики сальмонеллёзов.

1.Учет посевов сальмонелл на среде Левина и Олькеницкого (демонстрация).

2.Контроль чистоты наделенной культуры сальмонелл (со среды Олькеницкого при-

готовлен мазок, окрашен его по Граму). Промикроскопировать и зарисовать демонстрационные микропрепараты возбудителей сальмонеллёзов S.enterica spp. enterica ser. enteritidis, typhimurium, choleraesuis. Возбудители сальмонеллёзов — идентичные по морфологии грамотрицательные палочки с закругленными концами.

3.Идентификация выделенной культуры возбудителя:

-по антигенным свойствам – учет ориентировочной реакции агглютинации на стекле с диагностическими монорецепторными сальмонеллезными агглютинирующими О- и Н сыворотками в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта;

-по биохимическим свойствам - определение биохимической активности изучаемой культуры по "пестрому" ряду Гисса или Пешкова (демонстрация). Обратить внимание на расщепление глюкозы, отсутствие расщепления лактозы и сахарозы.

-по фаголизабельности (учет пробы с фагом - демонстрация)

4. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков (демонстрация).

Педиатрические аспекты темы

Постановка реакции типа Видаля при пищевых токсикоинфекциях имеет важное диагностическое значение у детей раннего возраста, т.к. процент положительных гемокультур и выделения возбудителя из испражнений невысок. Диагностическим титром является положительная реакция с разведением сыворотки 1:100.

43

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей брюшного тифа, паратифов и сальмонеллезов, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить РА на стекле и реакцию Видаля при брюшном тифе, оценивать результаты микробиологических анализов при бруцеллезе, лептоспирозе, боррелиозе, листериозе.

Тема 6. МИКРОБИОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ПАТОГЕННЫЕ КИШЕЧНЫЕ ПАЛОЧКИ, ИЕРСИНИИ, КАМПИЛОБАКТЕРИИ, ХЕЛИКОБАКТЕРИИ

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных кишечных инфекций - патогенных кишечных палочек, иерсиний, кампилобактерий, геликобактерий, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1 . Эшери х ии . Их основные свойства. Физиологическая роль в кишечнике человека и санитарно-показательное значение эшерихий, их значение в генетических и генно-инженерных работах. Диареегенные эшерихии, их дифференциация от условно-патогенных. Микробиологическая диагностика энтеральных и парентеральных эшерихиозов. Этиотропное лечение.

2.Иерсинии – возбудители кишечного иерсиниоза. Биологические свойства. Патогенность для человека и животных. Микробиологическая диагностика иерсиниозов. Этиотропная терапия.

3.Кампилобактерии. Хеликобактерии. Таксономия. Морфологические, культуральные,

биохимические и серологические свойства. Патогенность для человека и животных. Патогенез кампилобактериозов у человека. Роль хеликобактерий в возникновении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия.

Микробиологическая диагностика эшерихиозов

Среди видов Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae, наряду с непатогенными кишечными палочками - представителями нормальной микрофлоры кишечника, имеются их патогенные варианты, в том числе:

энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) - возбудители энтерогеморрагического эшерихиоза с гемолитико-уремическим синдромом);

энтероинвазивные (ЭИКП), вызывающие заболевания, сходные с дизентерией;

энтеротоксигенные (ЭТКП), вызывающие холероподобный эшерихиоз или диарею путешественников;

ЭПКП (энтеропатогенные) - возбудители детских колиэнтеритов и других кишечных инфекций, а также уропатогенные эшерихии, поражающие мочевыводящие пути.

Наиболее часто встречающиеся серовары патогенных эшерихий, входящих в состав пере-

численных групп, представлены в таблице 11.

Таблица 11. Серовары наиболее часто встречающихся патогенных эшерихий.

Часть эшерихий относится к условно-патогенным микроорганизмам, способных вызывать оппортунистические инфекции (пневмонии, нагноения ран и полостей, менингиты, сепсис и т.д.).

44

При накоплении в пищевых продуктах эшерихии могут стать причиной пищевого отравления. Методы микробиологической диагностики эшерихиозов отражены в схеме 11.

Бактериоскопический метод в диагностике эшерихиозов в практике бактериологических лабораторий не применяется из-за сходства морфологических и тинкториальных свойств патогенных и условно-патогенных энтеробактерий.

Бактериологический метод является основным методом диагностики эшерихиозов. Для выделения эшерихий используют среды Эндо, Левина и среду Мак-Конки с сорбитом для выделения

Escherichia coli 0157 : HI из группы ЭГКП.

Схема 11. Микробиологическая диагностика эшерихиозов

Экспресс-методы (индикация патогенной E.coli или ее продуктов в исследуемом материале)

ДНК-зонды или ПЦР для выявления специфического фрагмента ДНК патогенной E.coli Материал для исследования: испражнения, слизь с ректального тампона

РИФ

Бактериологический метод

1 день. Посев материала на среду Эндо, Левина и Мак-Конки с сорбитом Культивирование в течение суток при 370 С.

2 день. Учет характера роста на средах Эндо, Левина (гладкие, выпуклые, с ровными краями колонии, окрашенные в результате разложения лактозы, с характерным металлическим блеском) и Мак-Конки (бесцветные колонии). Постановка ОРА со смесью специфических эшерихиозных ОКсывороток и содержимого 10 лактозоположительных колоний. Пересев оставшейся части колонии уколом в столбик и штрихом на поверхность скошенной части среды на полускошенную среду Ресселя (или Олькенцикого) с целью накопления культуры.

3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого (пожелтение и разрывы столбика среды в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях, пожелтение скошенной части среды в результате ферментации лактозы и сахарозы). Проверка чистоты выделенной культуры, постановка ОРА с поливалентной ОК-сывороткой, а затем — развернутой РА с адсорбированными групповыми сыворотками для определения ОК-серогруппы. Определение антигенов выделенной культуры по результатам постановки развернутой РА с ОК сывороткой (или диагностическим иммуноглобулином) и живой культурой (типирование по К- антигену), а также развернутой РА с ОК сывороткой и гретой (кипяченой в течение 1-2 ч) культурой с целью определения специфического О-антигена. Постановка развернутой РА, пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств, посев для определения фаголизабильности, фаговара, колициногеновара.

4-й день. Учет результатов развернутой РА, изменений в средах «пестрого» ряда, фаголизабильности, фаговара, колициногеновара. Формулировка ответа при наличии положительной РА с кипяченой культурой (наличие специфического О-антигена)

Серологический метод - РА, РНГА, ИФА с целью выявления антител к эшерихиям и их динамики (исследование парных сывороток) в процессе инфекции.

Через 18 —24 ч инкубации при 370 С изучают характер колоний (гладкие, выпуклые, с ровными краями колонии, окрашенные в красный цвет в результате разложения лактозы, с характерным металлическим блеском), выросших на плотных питательных средах. Патогенные эшерихии по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам не отличаются от обычных эшерихий, обитающих в кишечнике человека. Исключение составляют лактозоотрицательные ЭПКП. Принадлежность выделенных микроорганизмов к патогенным эшерихиям устанавливают по антигенной структуре с помощью ОРА со смесью специфических эшерихиозных

45

ОКсывороток и содержимого 10 лактозоположительных колоний. На среде Мак-Конки с сорбитом ЭГКП образуют бесцветные колонии, тогда как другие эшерихии ферментируют сорбит, образуя красные колонии.

При положительном результате РА оставшуюся часть колонии пересевают уколом в столбик и штрихом на поверхность скошенной части среды на комбинированную полускошенную полиуглеводную среду (например, Ресселя) с целью накопления культуры.

На 3-й день учитывают изменения на среде Ресселя. Ферментацию глюкозы с образованием кислоты или кислоты и газа выявляют по изменениям столбика агара (пожелтение и его разрывы среды в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях) и скошенной части (пожелтение в результате ферментации лактозы и сахарозы). При отсутствии ферментации углеводов среда приобретает щелочную реакцию за счет выделения аминов при разложении белка и приобретает красный цвет. Проверяют чистоту выделенной культуры, определяют ее биохимические свойства (посев на среды Гисса); проводят серотипирование путем постановки сначала ориентировочной РА на стекле с поливалентной ОК-сывороткой, а затем — развернутой РА с адсорбированными групповыми сыворотками для определения ОК-серогруппы. Можно использовать латексные диагностикумы, покрытые соответствующими антителами (реакция латексной агглютинации).

Антигенную формулу выделенной культуры определяют по результатам постановки развернутой РА с ОК сывороткой (или диагностическим иммуноглобулином) и живой культурой (типирование по К-антигену), а также развернутой РА с ОК сывороткой и гретой (кипяченой в течение 1-2 ч) культурой с целью определения специфического О-антигена. Кипячение или автоклавирование разрушает поверхностно расположенный К-антиген, мешающий определению специфического О-антигена. Через сутки инкубирования при 370 С гомологичные сыворотке штаммы должны агглютинироваться до титра или до половины титра сыворотки.

Культуру, положительно прореагировавшую в развернутой РА с одной из сывороток, засевают на дифференциально-диагностические среды для окончательной идентификации. Для выявления источника инфекции и путей заражения у выделенного штамма определяют фаговар и колициногеновар.

У выделенных культур или в патологическом материале можно определить адгезивность и инвазивность микроскопическим методом с использованием культур ткани Нер-2 или HeLa, а также плазмиды вирулентности с помощью ДНК-зондов или ПЦР.

Для ускоренной идентификации возбудителя в исследуемом материале применяют прямой или непрямая РИФ.

Серологический метод является вспомогательным, направленным на обнаружение антител и их динамики в процессе инфекции (исследование парных сывороток) с помощью РА, РНГА, ИФА.

Самостоятельная работа студентов

1.Бактериологический метод. Изучить этапы выделения чистой культуры возбудителя:

Учет посевов фекалий от больного с подозрением на эшерихиоз на средах Эндо, Левина, Ресселя, Олькеницкого, скошенном MПA (демонстрация).

Провести контроль чистоты выделенной культуры. Со скошенного МПА приготовлен мазок, окрашен по Граму. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный препарат кишечной палочки. Escherichia coli – беспорядочно расположенные грамотрицательные палочки с закругленными краями.

Идентификация выделенной культуры возбудителя по антигенным свойствам. Учесть ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с комплексной ОВ-коли сывороткой (О- 111, О-55, О-26) и типовыми О-коли сыворотками О-III, 0-55, О-26. Учесть развернутую реакцию агглютинации, поставленную с живой и кипяченой культурами и типовой сывороткой, с которой была положительная ориентировочная реакция агглютинации (демонстрация). Положительное заключение выдается только при положительной РА с убитой культурой (обнаружение специфического О-антигена).

2.Серологический метод. Учет демонстрационных реакций (РА, РНГА, ИФА) в парных сыворотках больных с целью определения нарастания титра антител к возбудителям эшерихио-

46

зов.

3. Биопрепараты для диагностики эшерихиозов: типовые агглютинирующие 0-коли сы-

воротки 0-111,0-55, 0-26.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов

Энтеропатогенные иерсинии (Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis) вызывают кишечные инфекции, характеризующиеся поражением лимфоидного аппарата кишечника, ток- сико-аллергическими осложнениями, развитием генерализованных процессов.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает бактериологическое и серологическое исследования.

Бактериологическое исследование. Материал, подлежащий исследованию (фекалии, кишечные биоптаты, лимфоузлы или ткань удаленного аппендикса, кровь, слизь из ротоглотки), обрабатывают в течение 1 минуты 0,5% раствором гидроксида калия в 0,5% хлориде натрия, затем делают посевы на агар CIN, Серова или среду Эндо, которые после посева инкубируют при 32 °С в течение 24—48 ч или 24 ч при 370 С и столько же при комнатной температуре. Параллельно посевы помещают в холодильник при температуре +40 С (иерсинии хорошо растут при низких температурах). Пересевы со среды накопления выполняют на 3, 5, 10, 15-е сутки на указанные выше питательные среды.

На 2-й (3-й) день изучают первичные посевы. Энтеропатогенные иерсинии образуют более мелкие колонии, чем прочие энтеробактерии, на среде CIN колонии имеют красный центр и бесцветную периферию («бычий глаз»), на среде Эндо колонии бесцветные или с более интенсивно окрашенным центром. У Y. enterocolitica и у Y. pseudotuberculosis часто наблюдается диссоциация колоний с переходом в R (шероховатые) формы. Характерные для иерсиний колонии пересевают для накопления чистой культуры на скошенный МПА или на среду Ресселя или Олькеницкого.

На 3-й (4-й) день проводят идентификацию чистой культуры по биохимическим и антигенным свойствам (биовар, серогруппа с помощью РА у культур, выращенных при температуре ниже 300 С), учитывают температуру физиологического оптимума иерсиний (28-300 С), определяют чувствительность к антибиотикам. Возбудители иерсиниоза и псевдотуберкулеза оксидазоотрицательны, ферментируют до кислоты глюкозу, обладают нитратредуктазой и другими свойствами

(см. табл. 5).

В отличие от возбудителя псевдотуберкулеза, бактерии вида Y. enterocolitica по биологическим свойствам гетерогенны, включая безусловно-патогенные, условно-патогенные (возбудители оппортунистической инфекции или пищевого отравления) и непатогенные для человека иерсинии. Определение факторов вирулентности у Y. enterocolitica предполагает постановку реакций аутоагглютинации и кальцийзависимости, пиразинамидазного теста, определение плазмидассоциированных антигенов.

Тест аутоагглютинации. В две пробирки со средой Кларка засевают исследуемый штамм, инкубируют в течение 24 ч одну пробирку при 370 С, другую - при 26 - 280 С. При наличии вирулентности бактерии, выращенные при температуре 370 С, склеиваются в виде хлопьев, оседающих на дно и стенки пробирки. Культура, инкубированная при температуре 26 – 280 С, не агглютинируется.

Определение пиразинамидазной активности. На скошенную среду с пиразинамидом,

засевают исследуемые культуры, выращенные при температуре 25-300 С на ПА, инкубируют при той же температуре в течение 48 часов, после чего смачивают скошенную поверхность раствором сульфата аммонийного железа, оставляя пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин. В пробирках с культурами патогенных иерсиний цвет среды остаются без изменений; непатогенные иерсинии меняют цвет скошенной части среды на коричневый.

Тест кальцийзависимости ставят на кальций-дефицитном агаре, который готовят путем добавления раствора оксалата натрия к расплавленному МПА. После перемешивания вносят 4 мл 0,5М раствора хлорида магния. Исследуемую культуру засевают на 2 чашки с кальцийдефицитным агаром, одну чашку инкубируют 24 — 48 часов при 370 С, другую - при 26 - 280 С. При наличии вирулентности при дефиците кальция у клеток, инкубированных при 37 °С (но не 26 – 280 С), прекращается рост бактерий, при этом колонии на чашке либо имеют карликовые

47

размеры (Y. enterocolitica), либо отсутствуют совсем (чаще у Y. pseudotuberculosis). При 26 – 280 С так же, как у непатогенных иерсинии при двух температурных режимах, наблюдается рост колоний обычных размеров.

Серологическое исследование заключается в постановке РА, РНГА или ИФА с иерсиниозными диагностикумами и парными сыворотками крови больных с подозрением на иерсиниоз с целью определения специфических антител.

Генодиагностика – обнаружение типичных фрагментов ДНК патогенных иерсиний в клиническом материале или пищевых продуктах методами ДНК-ДНК-гибридизация или ПЦР-анализа.

Самостоятельная работа студентов

1.Бактериологический метод. Изучение культуральных (на среде Эндо и скошенном МПА) и биологических (тесты аутоагглютинации и кальцийзависимости, определение пиразинамидазной активности) свойств Y.enterocolitica (демонстрация).

2.Серологический метод учет РНГА, поставленной с иерсиниозным эритроцитарным диагностикумом и сыворотками крови больного, взятыми на 3 и 10 дни заболевания (демонстрация).

3.Серологический метод учет ИФА, поставленной с сыворотками крови больного, взятыми на 3 и 10 дни заболевания (демонстрация).

Микробиологическая диагностика кампилобактериозов

Возбудителями кампилобактериозов - кишечных инфекций, склонных к генерализации и выраженным токсико-аллергическим осложнениям, являются Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Оппортунистические инфекции различной локализации и тяжести вызываются пре-

имущественно Campylobacter fetus.

Материалом для исследования в зависимости от характера заболевания являются испражнения, гной, ликвор, кровь, рвотные массы и др., которые с учетом нестойкости возбудителя во внешней среде должны быть доставлены в лабораторию как можно скорее.

Бактериоскопический метод является весьма чувствительным ввиду характерной морфологии кампилобактеров (грамотрицательные изогнутые, S-образные или извитые палочки размером 0,2- 0,9x0,5-5,0 мкм).

Бактериологический метод. Для выделения чистых культур исследуемый материал засевают на селективные плотные среды (с кровью, факторами роста и антибиотиками) или используют для выделения метод фильтрации. Неконтаминированный материал засевают на неселективные среды обогащения (бруцеллезные бульон или агар, содержащий пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу и гидросульфит натрия в качестве редуцента).

Селективные среды (Скирроу, Престона, эритрит-агар) для кампилобактеров содержат баранью кровь (фактор роста) и селективные добавки (антибиотики триметоприм, ванкомицин, амфотерицин Д, полимиксин В и цефалотин), ингибирующие рост нормальной микрофлоры. Культивирование кампилобактеров осуществляется в специальной газовой атмосфере, состоящей из азота, углекислого газа и кислорода в соотношении 85:10:5, которая создается применением специальных газогенераторных пакетов, помещаемых вместе с посевами в герметично закрывающиеся емкости. Посевы инкубируют при 420 С.

Метод фильтрации основан на способности подвижных кампилобактеров активно проходить через мембранные фильтры с порами диаметром 0,45 — 0,65 мкм. Фильтр укладывают на поверхность неселективной плотной среды в чашке Петри, наносят на него 10—15 капель суспензии фекалий, инкубируют чашку при 370 С в течение 1 ч, после чего фильтр снимают, а чашку инкубируют в микроаэрофильных условиях. Проникшие через фильтр кампилобактеры образуют через 48 — 96 ч на поверхности среды характерные колонии - серые, плоские, с неровным краем, сливающиеся по ходу штрихов. На более сухих средах колонии выпуклые, блестящие, округлые, без выраженной тенденции к распространению; гемолиз отсутствует.

Выделенные культуры идентифицируют по морфологии (мазки, окрашенные по Граму), характерной «винтообразной» подвижности (исследование в препарате «раздавленная капля с использованием темнопольной или фазово-контрастной микроскопии), биохимическим свойствам и чувствительности к антибиотикам. Основные свойства некоторых видов кампилобактеров и Heli-

48

cobacter pylori представлены в таблице 12. Важным признаком С. jejuni является гидролиз гиппурата натрия (в 0,4 мл 1% водного раствора гиппурата суспендируют петлю выделенной культуры, пробирку помещают на 2 часа в термостат при 370 С, после чего добавляют 0,2 мл 3,5% раствора нингидрина в ацетон-бутаноловой смеси и вновь помещают в термостат). Пурпурное окрашивание взвеси свидетельствует о положительная пробе. Культура с типичной морфологией, выросшая при 42 °С на селективной среде, положительными пробами на оксидазу и на гидролиз гиппурата, относится к виду С. jejuni.

Нитратный тест культуру выполняют на нитратном бульоне Барретта или полужидкой среде Мюллера-Хинтона с 0,2 % нитрата калия; тест-реактивом является сульфоновая кислота в смеси с нафтиламином. Положительный нитратный тест характеризуется появлением красного окрашивания.

Таблица 12. Дифференциация некоторых видов кампилобактеров и Helicobacter pylori

Обозначения: (+) - наличие свойства, (-) - отсутствие свойства, (±) – непостоянное свойство

Генодиагностика. Для диагностики кампилобактериоза предложена ПЦР.

Серологическая диагностика при кампилобактериозе не проводится из-за наличия у кампилобактера групповых антигенов и возникновения вследствие этого перекрестных реакций антител против этого микроорганизма с другими микробами.

Самостоятельная работа студентов

1.Изучение морфологии Campylobacter jejuni (грамотрицательные изогнутые, S-образные или извитые палочки - демонстрация).

2.Учет культуральных свойств Campylobacter jejuni на эритрит-агаре (серые, плоские, сливающиеся колонии с неровным краем - демонстрация).

Микробиологическая диагностика геликобактериоза

Возбудителем геликобактериоза — хронической инфекции желудка и 12-перстной кишки — является Helicobacter pylori.

Материалом для исследования являются биоптаты слизистой оболочки из очагов поражения, желудочный сок, секционный и резекционный материал (слизистая оболочка тела, антрального и пилорического отделов желудка, луковицы 12-перстной кишки), реже материал из полости рта (зубной налет, материал у воспаленных десен). Исследование необходимо проводится сразу ввиду нестойкости геликобактера во внешней среде; допускается непродолжительное хранение материала (до 4 ч) в транспортных средах для кампилобактеров при 40 С.

Бактериоскопический метод - исследование гистологических срезов, окрашенных гема- токсилин-эозином, из биоптата слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки, полученного при фиброгастродуоденоскопии. При микроскопии геликобактеры имеют характерную спиралевидную морфологию.

49

Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике геликобактериоза. Для выделения чистых культур материал засевают на селективные плотные среды с кровью и антибиотиками (ванкомицин, амфотерицин В - по 10 мкг/мл и цефсулодин или триметоприм - 5 мкг/мл) , в которые для инактивации образующихся при культивировании ингибиторов можно добавить активированный уголь или крахмал, а также на неселективные питательные среды (бруцеллезный агар с 5 — 7 % лошадиной крови). Посевы инкубируют в анаэробных контейнерах с газогенераторными пакетами до 7 сут при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % кислорода и 10 % углекислого газа.

Колонии геликобактеров на питательных средах мелкие или достаточно крупные, серые прозрачные. В мазках из колоний обнаруживают слегка изогнутые или прямые, реже, типичные грамотрицательные спирально изогнутые бактерии. При темнопольной или фазово-контрастной микроскопии выявляют характерную подвижность клеток возбудителя. Для идентификации возбудителя проводят также биохимические и другие тесты (табл. 11 ).

Для этого чистую культуру геликобактера засевают на одну из сред с мочевиной и инкубируют ее в течение от 15 мин до 24 ч. В случае наличия уреазы происходит разложение мочевины с образованием щелочного продукта – аммиака, сопровождающееся изменением цвета индикатора среды.

Серодиагностика. Применяют РП, РНГА, РСК, ИФА для определения антител в крови больных хеликобактериозом. С помощью ИФА определяют специфические антитела класса IgG, которые выявляются у больных с высокой частотой, более длительно персистируют и отражают активность патологического процесса.

Экспресс-диагностика – прямая РИФ (специфическое свечение хеликобактеров в препаратах слизистой оболочки)

Генодиагностика. Применяют ПЦР как экспресс-метод для обнаружения специфических фрагментов ДНК Helicobacter pylori в материале от больного.

Самостоятельная работа студентов

Изучение морфологии Helicobacter pylori (грамотрицательные спиралевидные бактерии - демонстрация).

Учет культуральных свойств Helicobacter pylori на эритрит-агаре (серые, плоские, прозрачные сливающиеся колонии с неровным краем - демонстрация).

Учет уреазной активности Helicobacter pylori (отметить изменение цвета индикатора, свидетельствующее об изменении рН среды на щелочную в результате разложения мочевины с образованием аммиака).

Учет ИФА по определению антител класса IgG к геликобактеру (демонстрация).

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей эшерихиозов, иерсиниозов, кампилобактериозов, геликобактериозов, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: уметь ставить ориентировочную и развернутую РА для идентификации эшерихий, оценивать результаты микробиологических анализов при эшерихиозах, иерсиниозах, кампилобактериозах, геликобактериозах .

Тема 7. МИКРОБИОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ВОЗБУДИТЕЛИ ДИЗЕНТЕРИИ, ХОЛЕРЫ. ПИЩЕВЫЕ ИНТОКСИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных кишечных инфекций - дизентерии, холеры, пищевых интоксикаций бактериальной природы, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

50