Chastnaya_mikrobiologia

Индикацию энтеровирусов проводят по ЦПД и бляшкообразованию под слоем агара или бентонита в культуре клеток, характеру развитию параличей у мышей-сосунков. Идентификация энтеровирусов проводится с помощью РН (в культуре клеток или на мышах-сосунках), РТГА (при наличии у вируса гемагглютинина), РСК, РПГ, РИФ с типоспецифическими сыворотками против соответствующих энтеровирусов.

Серологический метод - постановка РН (на культуре ткани – обычно вариант «цветной» пробы или на мышах-сосунках), РСК (как правило, для диагностики полиомиелита; диагностический титр 1:32), реже РТГА с целью констатации нарастания титра антител к энтеровирусам в парных сыворотках больных.

Лабораторная диагностика ящура (вирус относится к роду Aphtovirus, семейству

Picornaviridae), проявляющегося везикулезной сыпью на коже и слизистых оболочках в результате контакта с больными ящуром сельскохозяйственными животными, осуществляется с помощью экспресс-метода (РИФ для обнаружения специфического антигена вируса в содержимом везикул) и культурального метода. Вирус ящура выделяют в культуре клеток крупного рогатого скота, коз, хомяков, идентифицируя с помощью РН, РСК, РИФ. Для выделения вируса проводят также биопробу (заражение морских свинок внутрикожно или мышей-сосунков в мозг). Серологический метод диагностики ящура заключается в исследовании парных сывороток с целью определения наличия и нарастания титра специфических антител с помощью РН и РСК.

Самостоятельная работа студентов Лабораторная диагностика полиомиелита

1.Вирусологический метод. Изучение ЦПД вируса полиомиелита. Фильтратом испражнений больного полиомиелитом, обработанных антибиотиками, заражена культура клеток ФЭЧ (фибробласты эмбриона человека). ЦПД вируса полиомиелита при микроскопии культуры ткани под малым увеличением проявляется мелкозернистой деструкцией клеток с образованием в них гранул, оттесняющих ядро к периферии. Микрокартину описать, зарисовать.

2.Серологический метод (ретроспективная диагностика). Выявление антител в парных сыворотках крови больного полиомиелитом с помощью цветной пробы. В пробирках, где не происходит репродукции вируса в результате нейтрализации его антителами, среда окрашивается в желтый цвет из-за образования клетками культуры ткани кислых продуктов метаболизма. Диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титра антител.

3.Дифференциация вирусов Коксаки А и В - биологический метод. Фильтрат испражнений больного, обработанный антибиотиками, вводят внутрибрюшинно 1-4 дневным мышам-сосункам. Мыши заболевают на 3 -7 день. Вирусы Коксаки А вызывают вялые параличи, Коксаки В – спастические.

4.Изучить биопрепараты для профилактики, диагностики и лечения:

диагностические типоспецифические сыворотки для типирования вирусов полиомиелита, Коксаки и ECHO;

отечественная живая вакцина против полиомиелита, содержащая вакцинные вирусы трех типов. В России зарегистрированы также 3 вакцины для профилактики полиомиелита фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция): Полио Сэбин-ВЕРО – живая вакцина, Имовакс полио - инактивированная вакцина, Тетракокк – комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита.

иммуноглобулин нормальный человеческий.

Лабораторная диагностика вирусных гепатитов

В настоящее время известно 8 гепатотропных вирусов (A - HAV, B - HBV, C - HCV, D - HDV, E - HEV, F - HFV, G – HGV, а также TTV - transfusion transmitted virus, передающийся при трансфузиях). Поражения печени могут вызывать и другие вирусы (например, цитомегаловирус, герпесвирусы и т.д.). В связи с трудностью культивирования вирусов гепатитов ведущая роль в лабораторной диагностике вирусных гепатитов отводится серологическим методам, а в последнее время - методам генодиагностики (ПЦР).

Гепатит А

111

Вирус гепатита A (HAV) относится к семейству пикорнавирусов, роду Hepatovirus. Материалом для исследования являются фекалии больного. Вирус гепатита А интенсивно

выделяется с фекалиями больных в течение нескольких дней в конце инкубационного периода до появления клинических проявлений инфекции, после чего его концентрация резко снижается.

Экспресс-диагностика заключается в постановке ИЭМ, РИА, ИФА с целью выявления вируса или его антигенов в экстракте фекалий.

Вирусологический метод состоит в заражении фильтратом фекалий чувствительных животных (шимпанзе и обезьян-мармозеток), а также культуры лимфоцитов человека. Индикацию и идентификацию вируса проводят с помощью РИФ или электронной микроскопии.

Серологический метод – выявление антител класса IgM к вирусу гепатита А, появляющихся в ранние сроки инфекции и указывающих на свежее инфицирование, а также антител класса IgG (обычно с помощью ИФА или РСК, редко - ИЭМ, РИА).

Генодиагностика. Для диагностики гепатита А разработана ПЦР, однако она широко не применяется, так как метод ИФА позволяет в уже ранние сроки инфекции обнаружить антитела класса IgM к данному вирусу.

Гепатит В

Вирус гепатита В (HBV) относится к роду Orthohepadnavirus семейства Hepadnaviridae, содержит поверхностный антиген HBsAg и два внутренних - HBcAg (cor -сердце) и HBeAg, (ДНКполимераза), к которым у больного образуются соответствующие антитела.

Экспресс-диагностика гепатита В включает определение HbsAg, с помощью ИФА, РИА, РОНГА, РПГ, встречного иммуноэлектрофореза, РИМ, РОНГА. Антиген появляется в сыворотке крови больного в инкубационном периоде за несколько недель (до 8) до повышения активности аминотрансфераз.

Серологическое исследование - выявление в сыворотках крови больных и носителей антител к антигенам HBV с помощью ИФА, РНГА РПГ, реже - РИА, РВИЭФ. Определение антигенов HBV и антител к ним имеет важное диагностическое и прогностическое значение. В инкубационном периоде в течение 2-5 месяцев выявляется HBsAg, а при хроническом течении более длительный промежуток времени. Острый период инфекции характеризуется появлением HBcAg и HbeAg (обнаруживается в крови в течение 1-7 недель; его появление на 1-3 неделе болезни является неблагоприятным прогностическим признаком). В стадию ранней реконвалесценции из крови исчезают HBcAg и HbeAg, но появляются и затем нарастают антитела к НВс и НВе антигенам. Стадия поздней реконвалесценции характеризуется наличием антител ко всем трем антигенам

HBV.

При хроническом агрессивном гепатите В в крови обнаруживаются HBsAg и HbeAg. Для этой формы гепатита характерно высокое содержание антител к НВс антигену класса IgM, что указывает на активную репродукцию вируса.

У носителей вируса гепатита В в крови выявляются HbsAg, антитела к HbcAg и НВеAg класса IgM, редко – антитела к HbcAg и к HbsAg класса IgG.

В крови больных гепатитом В могут быть обнаружены также дельта-частицы (или дельтаантиген), представляющие собой вирусы гепатита D, часто ассоциированные с вирусом гепатита В.

Генодиагностика. Разработано несколько методов генодиагностики (методы гибридизации, лигазная цепная реакция, ПЦР и др.). Наибольшее распространение получила ПЦР, являющаяся информативным методом при бессимптомных, хронических и смешанных формах гепатитов. ПЦР используют также для оценки уровня вирусемии и эффективности проводимого лечения.

Другие гепатиты

Вирус гепатита С (HCV) РНК-геномный представитель рода семейства Flaviviridae. Выделяют 6 сероваров ЯСК, каждый из которых преимущественно встречается в определенной стране (например, 1-й тип — в США, 2-й тип — в Японии).

112

Вирус гепатита D (HDV) - дефектный сателлитный РНК-содержащий вирус, осложняющий течение гепатита В, входит в род Deltavirus семейства Togaviridae,. Самостоятельную инфекцию не вызывает.

Вирус гепатита Е (HEV) - РНК-геномный представитель рода Calicivirus семейства

Caliciviridae,

Вирус гепатита G (HGV) условно относящийся к семейству Flaviviridae.

Серологический метод является в реальной практике основным методом лабораторной диагностики указанных гепатитов, т.к. культивирование этих вирусов связано с большими трудностями. Антитела к вирусам гепатитов в парных сыворотках крови больных выявляют с помощью ИФА, РИА, ИЭМ, РИФ с дифференциацией антител по классам иммуноглобулинов (в частности по IgM - маркеру свежего инфицирования). Антитела класса IgM к вирусам гепатитов D, Е и G появляются через 10-15 дней после начала клинических проявлений инфекции, к вирусам гепатита С – через 3 месяца. Антитела класса IgG IgM к вирусу гепатита D можно выявить спустя от 2 до 11 недель, а к вирусам Е и G через 30 дней после перенесенной инфекции. Подтверждающим лабораторным методом является иммуноблотинг.

Генодиагностика. Важным методом диагностики HCV инфекции является ПЦР, которая позволяет выявить виремию и ее уровень по содержанию РНК вируса в крови у бессимптомных носителей вируса, а также у больных уже в инкубационном периоде (задолго до появления антител) и в период разгара инфекции, что имеет важное значение для выбора обоснованной терапии и прогнозирования инфекции. ПЦР является единственным методом, позволяющим отличить перенесенный гепатит С от имеющейся инфекции у данного пациента в данный момент.

ПЦР позволяет выявить также РНК вируса гепатита D при всех вариантах этой инфекции, подтверждая результаты определения антител к этому вирусу с помощью ИФА, т.к. результаты серологических исследований могут быть сомнительными или отрицательными в случаях связывания антител антигенами вируса.

Самостоятельная работа студентов 1. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов

Учет результатов ИФА, поставленного с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для определения антител классов IgM и IgG к вирусу гепатита А (демонстрация; положительная реакция характеризуется окрашиванием содержимого лунки в коричневый цвет).

Учет результатов РСК, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для определения антител к вирусу гепатита А (демонстрация; положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза).

Учет результатов ИФА, поставленного с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на вирусный гепатит), для обнаружения антигенов вируса гепатита В (демонстрация).

Учет результатов ИФА, поставленного с сывороткой крови больного (диагноз: подоз-

рение на вирусный гепатит), для определения антител к HBsAg вируса гепатита В (демонстрация).

Учет результатов РНГА, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подоз-

рение на вирусный гепатит), для определения антител к HBsAg вируса гепатита В (демонстрация; положительная реакция характеризуется склеиванием эритроцитов и выпадением их в осадок в виде «зонтика»). Диагностический титр 1:40.

Учет демонстрационной ПЦР при гепатите В.

Учет демонстрационной ПЦР при гепатите С.

3.Изучить биопрепараты для профилактики, диагностики и лечения вирусных гепатитов:

вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая жидкая отечественной фирмы «Комбиотех»;

Хебербиовак - вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая фирмы АО Эбер Биотек, Куба;

113

Н-В-Вакс - вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая фирмы Мерк Шарп Доум (США);

Энджерикс В - вакцина против гепатита В рекомбинантная дрожжевая фирмы Смит Кляйн Бичем (Бельгия);

ГЕП-А-ин-ВАК – отечественная (фирма «Вектор») культуральная инактивированная концентрированная очищенная адсорбированная жидкая вакцина против гепатита А;

Хаврикс 1440 – инактивированная вакцина против гепатита А фирмы Смит Кляйн Бичем (Бельгия);

Аваксим - инактивированная вакцина против гепатита А фирмы Авентис Пастер;

иммуноглобулин нормальный человеческий.

Вирусологическая диагностика ротавирусных гастроэнтеритов.

Ротавирусы (рота – колесо) человека относятся к семейству Rheoviridae, имеют морфологию, напоминающую колесо, и являются причиной около 50% гастроэнтеритов у детей. Материалом для исследования являются испражнения больного ребенка. В связи с трудностями культивирования ротавирусов, в реальной практике применяются экспресс и серологические методы лабораторной диагностики.

Экспресс-методы. Для определения ротавируса в фекалиях применяются электронная микроскопия, позволяющая обнаружить вирус с характерной морфологией в виде колеса, а также ИЭМ, РИФ, РОНГА. Наиболее чувствительным и доступным методом является ИФА, в меньшей мере - РИА.

Серологический метод. С целью обнаружения антител к ротавирусам и нарастания их титра в парных сыворотках крови больных применяются РТГА, РСК, ИФА, РИФ, ИЭМ.

После изучения темы студент должен знать: характеристику возбудителей энтерови-

русных и ротавирусных инфекций, вирусов гепатитов, а также принципы лабораторной диагностики, профилактики и лечения упомянутых инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: трактовать результаты лабораторных исследований при энтеровирусных и ротавирусных инфекциях, вирусных гепатитах.

Тема 16. АРБОВИРУСЫ. НЕЙРОВИРУСЫ. ОНКОГЕННЫЕ ВИРУСЫ. МЕДЛЕННЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ. РЕТРОВИРУСЫ

Цель занятия: разбор биологических свойств арбовирусов, нейровирусов, онкогенных вирусов, ретровирусов, возбудителей медленных вирусных инфекций, освоение методов лабораторной диагностики, профилактики и лечения указанных инфекций.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1.Тогавирусы (семейство Togaviridae). Общая характеристика, классификация. Структура вириона, антигены, методы культивирования. Чувствительность к физическим и химическим факторам. Альфа-вирусы (вирус Синдбис, западного и восточного энцефаломиелита лошадей и др.) и их характеристика (структура вирионов, антигены, резистентность к физическим и химическим факторам, методы культивирования, механизмы передачи инфекции, природная очаговость, роль в патологии человека).

2.Род рубивирусов. Вирус краснухи и его характеристика. Роль в патологии человека. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение тогавирусных инфекций.

3.Флавивирусы (семейство Flaviviridae), их характеристика, классификация, методы культивирования. Резистентность к физическим и химическим факторам. Основные представители, вызывающие заболевания у человека (вирусы желтой лихорадки, клещевого энцефалита, лихорадки денге, японского энцефалита, омской геморрагической лихорадки). Природная очаговость, механизмы передачи инфекции. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение.

4.Буньявирусы (семейство Bunyaviridae). Общая характеристика и классификация. Морфология вириона, антигены, культивирование. Чувствительность к действию физических и химических факторов. Буньявирусы, распространенные на территории России (вирус крымской

114

геморрагической лихорадки, вирусы москитных лихорадок, вирус геморрагической лихорадки с почечным синдромом, хантавирусы). Роль в патологии человека. Механизмы передачи инфекции. Лабораторная диагностика, проблемы специфической профилактики.

5.Рабдовирусы (семейство Rhabdoviridae). Общая характеристика и классификация. Вирус бешенства, его структура и методы культивирования. Внутриклеточные включения (тельца Бабеша–Негри) при бешенстве. Резистентность к физическим и химическим факторам. Механизм передачи инфекции. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика бешенства.

6.Ретровирусы (семейство Retroviridae). Общая характеристика, классификация. Вирус иммунодефицита человека и его свойства (морфология, химический состав, особенности генома, изменчивость и ее механизмы, типовой состав и классификация, методы культивирования). Происхождение и эволюция ВИЧ. Резистентность к действию физико-химических факторов. Особенности инфекционного процесса и иммунологических нарушений при СПИДе. СПИДассоциированные инфекции. Лабораторная диагностика, лечение, меры борьбы с инфекцией и перспективы специфической профилактики ВИЧ-инфекции.

Вопросы для самостоятельного изучения

1.Аренавирусы (семейство Arenaviridae). Общая характеристика и классификация. Основные представители, вызывающие заболевания у человека (вирусы лимфоцитарного хориоменингита, Ласса, Хунин, Мачупо).

2.Онкогенные РНК-содержащие вирусы семейства Retroviridae. Морфология, классификация, особенности взаимодействия с клеткой. Эндогенные и экзогенные ретровирусы. Механизм онкогенеза, вызываемого ретровирусами. Понятие об онкогене. Роль ретровирусов в канцерогенезе человека: HTLV-I- и HTLV-II-вирусы.

3.Онкогенные ДНК-содержащие вирусы. Семейство Papovaviridae. Морфология, классификация, особенности взаимодействия с клеткой. Вирусы папилломы и полиомы человека. Механизм вирусного канцерогенеза: роль белков р53 и Rb в развитии злокачественных новообразований, вызываемых паповавирусами. HBV-вирус. Роль НВх-антигена в развитии первичного рака печени. Представители семейства Herpesviridae, Adenoviridae, Poxviridae, способные вызвать трансформацию клетки и их характеристика.

4.Современные представления о возбудителях медленных вирусных инфекций. Персистенция вирусов и ее механизмы. Методы выявления персистирующих вирусов.

5.Прионы. Возбудители Куру, болезни Крейцфельда–Якоба. Патогенез прионных болезней человека и животных.

6.Парвовирусы (семейство Parvoviridae). Общая характеристика и классификация. Структура вириона. Антигены. Культивирование. Чувствительность к физическим и химическим факторам. Вирус В19, его значение в патологии человека.

Вирусологическая диагностика нейровирусных инфекций Арбовирусные инфекции

Термин арбовирусы (arthropod borne viruses – вирусы, передающиеся членистоногими) не является классификационным, а отражает одинаковый для этих вирусов путь передачи инфекции, характеризующейся природной очаговостью. Арбовирусы входят в состав нескольких семейств (Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Picornaviridae, Iridoviridae, Poxviridae, Arenaviridae) и насчитывают более 500 патогенных для животных и человека вирусов, среди которых около 100 являются патогенными для человека.

К арбовирусным инфекциям относятся:

системные лихорадки (флеботомная, Денге);

геморрагические лихорадки (желтая, Денге, Чикунгунья, крымская геморрагическая, омская геморрагическая, киассанурская лесная болезнь);

энцефалиты и энцефаломиелиты (клещевой энцефалит, американские, западный, восточный и венесуэльский лошадиный энцефаломиелит, энцефалит Сан-Луи, долины Муррея, западно-нильский, японский, африканский) и др.

Лабораторная диагностика арбовирусных инфекций имеет важное практическое значение, т.к. многие из них имеют одинаковые клинические проявления, нередко заболевание протекает в

115

атипичной или стертой форме. Кроме того, сходные с арбовирусными инфекциями могут вызывать другие вирусы, бактерии, риккетсии, спирохеты. Исследование на арбовирусы проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций.

Материалом для исследования являются кровь, спинномозговая жидкость, носоглоточные смывы, моча, плевральная жидкость, органы трупа (мозг, печень, селезенка, легкие, почки). Лабораторная диагностика арбовирусных инфекций у человека включает экспресс-методы, вирусологический и серологический методы (схема 22).

Схема 22. Вирусологическая диагностика арбовирусных инфекций

Материал для исследования: кровь, спинномозговая жидкость, носоглоточные смывы, моча, плевральная жидкость, органы трупа

Экспресс-диагностика – обнаружение специфических вирусных антигенов в материале от больного с помощью РИФ

Вирусологический метод: заражение РКЭ, культур клеток, белых мышей. Индикация вирусов с помощью РГА, учета ЦПД, по образованию бляшек, гибели мышей и куриных эмбрионов. Идентификация выделенных вирусов с помощью РН, РТГА, РСК, РИФ, РИА.

Серологический метод - исследование парных сывороток крови для выявления нарастания титра антител к арбовирусу с помощью РТГА, РСК, РН, РИФ, РНГА, РОНГА, РРГ, ИФА, РИА.

Экспресс-диагностика – обнаружение специфических вирусных антигенов в материале от больного с помощью РИФ (лихорадка Денге, крымская геморрагическая, колорадская лихорадка), РНГА или РОНГА с эритроцитарным антительным диагностикумом (крымская геморрагическая лихорадка, лимфоцитарный хориоменингит), ИФА (японский энцефалит). РИФ применяют также для обнаружения вирусного антигена в слюнных железах переносчиков и в гемолимфе клещей (клещевой энцефалит).

Вирусологический метод в диагностическом отношении имеет ограничения, связанные с длительностью его выполнения (до 3 недель). Вирус выделяют путем заражения новорожденных или взрослых белых мышей в мозг, внутрибрюшинно или подкожно, первично-трипсинированных или перевиваемых культур клеток (куриные фибробласты, клетки почек эмбриона свиньи, перевиваемые линии ВНК-21, СПЭВ, ПЭС, Vero, а также культуры тканей членистоногих - клещей, комаров). Реже заражают куриные эмбрионы в тело, амнион, желточный мешок, на ХАО. Заболевших в течение 2-3 недель мышей исследуют на наличие арбовирусов.

Индикацию вирусов проводят с помощью РГА (с гусиными эритроцитами), учета ЦПД, по образованию бляшек, гибели мышей и куриных эмбрионов. Идентификация выделенных вирусов осуществляется обычно с помощью РН, РТГА или РСК, реже - РИФ, РИА.

Серологический метод - исследование парных сывороток крови для выявления нарастания титра антител (в 4 раза и более) с помощью РТГА при наличии у арбовируса гемагглютинина, а при его отсутствии – РСК, РН, а также РИФ, РНГА, РОНГА, РРГ, ИФА, РИА.

Самостоятельная работа студентов

1.Учет РТГА, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на клещевой энцефалит), для определения антител к вирусу клещевого энцефалита (демонстрация; положительная реакция характеризуется торможением гемагглютинации).

2.Учет РСК, поставленной с сывороткой крови больного (диагноз: подозрение на клещевой энцефалит), для определения антител к вирусу клещевого энцефалита (демонстрация; положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза).

3.Изучить биопрепараты для профилактики, диагностики и лечения клещевого энцефалита:

116

отечественная инактивированная культуральная сорбированная жидкая вакцина для профилактики клещевого энцефалита;

отечественная инактивированная культуральная очищенная концентрированная вакцина для профилактики клещевого энцефалита;

FSME immun-inject - инактивированная культуральная вакцина для профилактики клещевого энцефалита фирмы Иммуно (Австрия);

Энцепур - инактивированная культуральная вакцина для профилактики клещевого энцефалита фирмы Кайрон Беринг (Германия);

гетерологичный противоэнцефалитный иммуноглобулин;

противоэнцефалитный иммуноглобулин, полученный из сыворотки крови иммунизированных убитой вакциной против клещевого энцефалита доноров, для профилактики и лечения;

диагностикум из вируса клещевого энцефалита;

типоспецифические диагностические сыворотки против вируса клещевого энцефали-

та.

Бешенство

Вирус бешенства относится к РНК-содержащим вирусам рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae и поражает центральную нервную систему с образованием в клетках головного мозга в области гиппокампа телец Бабеша-Негри, представляющих собой скопления вирусного антигена или самого вируса. Материалом для исследования являются спинномозговая жидкость, мокрота, моча, слюна, взятые на ранних стадиях болезни.

Экспресс-диагностика - обнаружение методом световой микроскопии телец Бабеша-Негри (наиболее распространенный метод) в мазках-отпечатках ткани гиппокампа, коры мозга и мозжечка, окрашенных по Романовскому-Гимзе, Туревичу или Муромцеву. Тельца Бабеша-Негри представляют собой цитоплазматические включения в нейронах, сферической или продолговатой формы, розовато-фиолетового цвета и размерами от 2 до10 мкм.

Вирусный антиген в мазках-отпечатках головного мозга, нижнечелюстных слюнных желез, слизистой оболочки полости рта выявляют обычно с помощью прямой РИФ. Вирус бешенства, имеющий характерную морфологию в виде пули можно выявить в препаратах мозга с помощью электронной микроскопии.

Вирусологический метод. Вирус бешенства можно выделить путем заражения новорожденных или взрослых белых мышей взвесью ткани головного мозга и других органов, погибших от инфекции людей, а также ликвором и слюной больных. При наличии вируса в исследуемом материале у мышей появляются мышечный тремор, расстройства координации, возбуждение или параличи. Через 5 дней животные погибают. Мозг заболевших мышей исследуют на наличие телец Бабеша-Негри или антигена вируса бешенства с помощью РИФ. Идентификацию проводят с помощью РН на мышах.

Серологический метод - выявление антител в сыворотке крови больных с помощью РН на мышах, РТГА, РСК, РИФ, ИФА.

При исследовании животного, нанесшего укус, определяют наличие вируса или вирусного антигена в ткани слюнной железы с помощью РИФ и биологической пробы.

Самостоятельная работа студентов

1.Выявление включений - телец Бабеша-Негри в ткани мозга животного, погибшего от бешенства (демонстрация).

2.Изучить биопрепараты, используемые для специфической профилактики и лечения бешенства:

Рабивак – отечественная культуральная инактивированная сухая антирабическая

вакцина;

отечественная культуральная инактивированная очищенная концентрированная сухая антирабическая вакцина;

культуральная инактивированная антирабическая вакцина фирмы Кайрон Беринг (Германия);

117

отечественный гетерологичный антирабический иммуноглобулин;

отечественный гомологичный антирабический иммуноглобулин;

Имогам Рабис гомологичный антирабический иммуноглобулин с консервантом фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция);

Имогам Раж -гомологичный антирабический иммуноглобулин без консерванта фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция);

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции

Возбудителями ВИЧ (Вирус Иммунодефицита Человека)-инфекции или СПИДа (Синдром Приобретенного ИммуноДефицита – обычно так обозначается терминальная стадия ВИЧинфекции) являются РНК-геномные вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1, ВИЧ-2, английская аббревиатура — HIV), входящие в семейство Retroviridae, подсемейство Lentivirinae.

Материалом для исследования с целью выделения вируса является кровь (Т-лимфоциты), биоптаты костного мозга (лейкоциты), пунктаты лимфатических узлов, сперма, спинномозговая жидкость, секционный материал, реже слюна.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции основана, прежде всего, на выявлении антител к ВИЧ в крови больных и ВИЧ-инфицированных, в последнее время – на методах генодиагностики, реже (в основном, в исследовательских целях) проводится вирусологическое исследование с целью выделения ВИЧ.

Вирусологический метод имеет серьезные ограничения, связанные с применением специальных культур лимфоцитов, требующих особых трудоемких условий культивирования. ВИЧ в культуре лимфоцитов вызывает образование симпластов с последующей гибелью лимфоцитов. Идентификацию вируса проводят с помощью РИФ, электронной микроскопии и определения активности типичного для ретровирусов фермента - РНК-зависимой-ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы).

Серологический метод наиболее распространен для лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции. Чаще всего используют ИФА, реже - РИА, РИФ.

Подтверждающим высокоспецифичным методом серологической диагностики ВИЧинфекции является метод иммуноблотинга. Реакция выполняется в несколько этапов. Сначала проводится электрофоретическое разделение белков ВИЧ с последующим перенесением их на нитроцеллюлозную мембрану. Затем мембрана обрабатывается исследуемой сывороткой крови, после чего на нее наносят антивидовые меченые ферментом или радиоактивным изотопом сыворотки с целью выявления антител к различным белкам ВИЧ с помощью ИФА или РИА. Результаты иммуноблотинга считают положительными при обнаружении антител к антигенам ВИЧ p24, p31, gp41, gp120.

Генодиагностика. Разработана качественная ПЦР для определения ДНК провируса с целью диагностики ВИЧ-инфекции, а также количественная ПЦР для выявления РНК вируса в крови как прогностический тест подтвержденной ВИЧ-инфекции.

Самостоятельная работа студентов

1.Выявление антител к ВИЧ методом ИФА (демонстрация, положительная реакция характеризуется окрашиванием содержимого лунки в коричневый цвет).

2.Определение антител к ВИЧ с помощью иммуноблоттинга (демонстрация, положи-

тельная реакция характеризуется окрашиванием зон, соответствующих антигенам ВИЧ p24, p31, gp41, gp120).

Вирусологическая диагностика парвовирусных инфекций

Парвовирусы (parvus — маленький) - простые по строению ДНК-геномные вирусы, входящие семейство Parvoviridae, насчитывают более 50 вирусов, из которых только один - парвовирус 5-19 вызывает заболевание у человека. Клинические проявления парвовирусной инфекции весьма разнообразны. Вирус вызывает патологию и гибель плода, воспалительную инфекцию матки, инфекционную эритему кожи (нередко с петехиальным синдромом), острые артропатии, васкулиты, тромбоцитопению, гемофагоцитарный синдром, транзиторный апластический криз, хронические инфекции у пациентов с иммунодефицитами, поражения сердца (миокардиты, арит-

118

мию сердечных сокращений, перикардиты), нервной системы (невралгические амиотрофии, нейропатии плечевого сплетения), гепатиты. В 20-50% случаев парвовирусные инфекции протекают бессимптомно. Выбор материала для исследования зависит от клинических проявлений парвовирусной инфекции. Во всех случаях исследуют сыворотку крови.

Серологический метод во многих случаях является единственным лабораторным методом, позволяющим подтвердить диагноз парвовирусной инфекции. Для определения антител к парвовирусу классов IgM (появляются через 14 дней после инфицирования, показатель свежего инфицирования) и IgG (показатель защитного иммунитета) в парных сыворотках крови больных используется ИФА, а также иммуноблотинг, который позволяет установить давность инфекции, в частности, сроки инфицирования беременных (антитела к антигену VP2 появляются раньше, чем антител к антигену VP1).

Вирусологический метод для практических целей лабораторной диагностики малоприменим, т.к. в обычных клеточных культурах парвовируса не культивируется. Вирус репродуцируется в очень низких титрах только в культурах клеток костного мозга человека, селезенки плода, пуповинной крови и культурах клеток периферической крови, стимулированных эритропоэтином. Идентификацию парвовируса в культуре клеток осуществляют с помощью РИФ (с целью выявления специфических антигенов) или более чувствительных методов генодиагностики (выявление вирусной ДНК с помощью ПЦР или ДНК-гибридизации). С помощью ПЦР удается выявить вирусную ДНК в сыворотке крови, мононуклеарных клетках периферийной крови, биоптатах синовиальной сумки и т.д. у больных, находящихся в инкубационном периоде и острой фазе инфекции.

Вирусологическая диагностика аренавирусных инфекций

Семейство аренавирусов представлено одним родом, который содержит около десяти антигенно родственных вирусов.

К семейству аренавирусов относятся возбудители лимфоцитарного хориоменингита (вирус ЛХМ), лихорадки Ласса, боливийской геморрагической лихорадки (вирус Мачупо), аргентинской геморрагической лихорадки (вирус Хунин).

Морфологически аренавирусы полиморфны, однако основная форма круглая, диаметр вириона 110-130 нм. Геном аренавирусов состоит из 5 фрагментов и представлен одноцепочечной РНК. Внутри вирусных частиц обнаружены характерные зернистые структуры, напоминающие песчаные вкрапления (arena – песок). Снаружи вирусы покрыты плотной оболочкой с асимметрично расположенными поверхностными отростками булавовидной формы. Аренавирусы размножаются в курином эмбрионе, в организме различных грызунов наличного возраста в зависимости от вида аренавируса, а также в культуре клеток.

Лимфоцитарный хориоменингит – распространен повсеместно, являясь зоонозной инфекцией. Основной хозяин вирусов – дикие грызуны (серые мыши, хомячки, полевки). Человек заражается от животных аэрозольным, алиментарным путями, а также при укусах кровососущих насекомых (клещей). Инкубационный период 6-7 дней. Заболевание протекает по типу гриппа с поражением капилляров, кровоизлияниями, сопровождаясь лейко- и тромбоцитопенией. Возможен асептический менингит или менингоэнцефалит. Прогноз благоприятный.

Лихорадка Ласса – эндемичная инфекция к югу от Сахары. Основной резервуар инфекции

– многососковая крыса, выделяющая вирус с мочой. Вирус передается путем контакта больных и здоровых лиц, от животных аэрогенным, алиментарным путями, что обеспечивает высокий риск заражения медицинского персонала больниц, а также семейных вспышек. Инкубационный период 7-8 дней, иногда до 20 дней. Начало заболевания постепенное (интоксикация, геморрагический синдром, язвенный фарингит, желудочные боли, отек лица и шеи, выпот в плевральную полость и в перикард). Летальность 43-67%.

Боливийская геморрагическая лихорадка (Мачупо) – природно-очаговая инфекция север-

но-восточных провинций Боливии. Резервуар инфекции мышевидные грызуны. Возбудитель передается человеку через воду и пищу, загрязненные мочой грызунов, а также воздушнокапельным путем от больного. Инкубационный период 7-14 дней. Характерен геморрагический синдром, дрожание конечностей и языка, протеинурия, поражение печени, выпадение волос и ломкость ногтей. Летальность свыше 30%.

119

Аргентинская геморрагическая лихорадка (Хунин) встречается в центральной части Аргентины. Источник инфекции – мышевидные грызуны. Человек заражается при вдыхании пыли или при употреблении продуктов, зараженных выделениями грызунов. Возможен трансмиссивный путь передачи инфекции. Заболевание протекает на фоне высокой интоксикации, с геморрагическим синдромом, поражениями почек печени, нервной и сердечнососудистой системы. Летальность 10-20%.

Вирусологическая диагностика аренавирусных инфекций основана на выделении вирусов путем заражения культуры клеток (клетки Vero, амниона человека, эмбриона мышей) с последующей идентификацией в РСК, реакциях нейтрализации или непрямой иммунофлюоресценции. Возможна постановка биопробы (используют белых мышей, морских свинок, обезьян). Серологические методы диагностики (РСК, РНГА) предполагают определение антител к соответствующим аренавирусам и служат целям ретроспективной диагностики. Разработана ПЦР.

Лечение и профилактика. Единственным эффективным методом лечения лихорадки Ласса

Вирусологическая диагностика филовирусных инфекций (Марбургская лихорадка и лихорадка Эбола)

Филовирусы представляют собой прямые (вирус Эбола) или извитые (вирус Марбурга) нити с закругленным концами. Вирус Марбурга может выглядеть в виде спиральных или V- образных нитей. Диаметр вириона – 70-100 нм, длина около 660 нм. Геном представлен молекулой одноцепочечной РНК. В центре вириона расположен спиральный рибонуклеопротеид, затем следует промежуточный слой. Вирус покрыт липопротеиновой мембраной, на поверхности которой обнаружены шипы. В составе вирионов выявлено 7 структурных белков. Оба вируса хорошо размножаются в культурах клеток обезьян, патогенны для обезьян и морских свинок.

Марбургская лихорадка впервые была описана в 1967 г. во время вспышки геморрагической лихорадки в Югославии и Германии (г. Марбург) у лиц, имевших контакты с мартышками из Уганды. Вирус может передаваться при контактах здоровых лиц с больными. Инкубационный период 3-9 дней, начало болезни острое. Быстро наступает прострация, выраженная лихорадка. Выраженный геморрагический синдром.. Характерна везикулезная сыпь, поражения печени, почек, нервной системы (сонливость, адинамия. Летальность 30-50%. В первые дни вирус обнаруживается в крови, моче и отделяемом носоглотки. Вирус в сперме переболевших мужчин обнаруживается до 3 месяцев.

Лихорадка Эбола (по названию реки в Заире).Вирус был впервые выделен в Судане и Заире в 1976 г. при вспышке тяжелейшей геморрагической лихорадки. (заболело 500 человек, умерло 350). Резервуаром вируса являются дикие грызуны или летучие мыши. Заболевают, как правило, взрослые, которые становятся источником инфекции в семьях и больницах. Болезнь передается при тесном контакте с больными, особенно с кровью или выделениями, содержащими кровь, а также с мокротой и спермой. Возможен воздушно-капельный (особенно среди персонала больниц) или половой пути заражения. Инкубационный период 3-16 дней. Начало болезни острое (сильная головная боль, лихорадка, миалгия, тошнота, боли в груди, сыпь, понос, тяжелый геморрагический синдром). Летальность – 90%.

Лабораторная диагностика лихорадок Марбурга и Эбола сводится к выделению вируса на культуре клеток с последующей его идентификацией с помощью РСК, реакции нейтрализации, реакций иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа. С помощью указанных методов проводится также выявление антигенов вирусов в материалах от больных. В период реконвалесценции диагностическое значение имеет определение нарастания комплементсвязывающих или вируснейтрализующих антител. Разработана ПЦР.

Лечение симптоматическое (поддержание водно-солевого баланса, функций печени и почек, борьба с геморрагическим синдромом). Рекомендуется переливание плазмы реконвалесцентов, интерферон.

120