Chastnaya_mikrobiologia

Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S - чувствительный; R – резистентный.

Для выявления плазмокоагулазы цитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Результаты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток.

В некоторых случаях у выделенных чистых культур стафилококка определяют наличие

ДНК-азы, каталазы, лизоцимной активности, фибринолизина, гиалуронидазы.

Лизоцимную активность выявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культурой Micrococcus luteus.

Определение ДНК-азы. Суточную агаровую культуру стафилококка засевают на МПА в чашке Петри, содержащий ДНК. После инкубации посевов при температуре 370 С в течение 1824 часов поверхность МПА заливают 1 N раствором соляной кислоты. Наличие ДНК-азы характеризуется появлением зоны просветления вокруг колоний.

Каталазный тест. Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода.

Cерологический метод в диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА.

Клинически значимые виды стафилококка Коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus

Коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, S.hominis

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопия мазков из чистой культуры золотистого стафилококка –

Staphylococcus aureus. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно, выглядят в виде гроздьев винограда

2.Учет характера роста золотистого стафилококка (демонстрация) на ЖСА

(расщепление лецитина в виде радужного венчика вокруг колоний) и кровяном МПА (гемолиз).

3.Дифференциация основных видов стафилококка (таблица 2) – (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus по образованию плазмокоагулазы, лецитиназы, альфа-токсина, ферментации маннита и глюкозы в анаэробных условиях - демонстрация).

4.Учет теста на антибиотикорезистентность методом бумажных дисков

(демонстрация).

5.Определение фаговара стафилококка (демонстрация).

6.Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций.

-стафилококковая вакцина - взвесь клеток коагулазоположительных штаммов S.aureus, убитая нагреванием. Используется для лечения вяло текущих стафилококковых инфекций;

-антифагин стафилококковый - экстракт из культур патогенных стафилококков, инактивированных при 1000 С, профильтрованный через бактериальный фильтр. Применяется для лечения хронических пиодермий;

11

-иммуноглобулин человеческий противостафилококковый - гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови, содержащая стафилококковые антитоксические антитела. Применяется с лечебной целью;

-стафилококковый бактериофаг (жидкий) - фильтрат фаголизата стафилококка.

Применяют наружно, внутрикожно и внутримышечно для лечения;

-диагностические стафилококковые фаги - набор типоспецифических фагов для фаготипирования стафилококков;

-стафилококковый анатоксин (очищенный адсорбированный) – получают из нативного анатоксина (токсин, обезвреженный формалином) путем осаждения трихлоруксусной кислотой и этанолом, с последующей адсорбцией на гидроксиде алюминия. Применяется для активной иммунизации с целью профилактики и лечения стафилококковых инфекций;

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций.

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций отражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.

Бактериоскопический метод – выявление в мазке из гноя патогенных кокков,

располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).

Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций

Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.

1.день. Посев материала на чашки МПА.

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 370 С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые

– для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по

12

антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.

Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест ФогесПроскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).

PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культуры стрептококка, инкубируют при 370 С в течение 4 ч. Положительная реакция характеризуется появлением ярко-красного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.

САМР-тест. S. agalactiae вырабатывают внеклеточный протеин синергидного гемолиза, усиливающий лизис эритроцитов β -лизином стафилококка. Для его определения на чашку с кровяным МПА засевают перпендикулярными штрихами исследуемую культуру стрептококка и суточную бульонную культуру стандартного β -гемолитического штамма Staphylococcus aureus. В качестве положительного и отрицательного контролей засевают соответственно культуры S. agalactiae и S. pyogenes, инкубация 18 ч при 37 °С. При положительном САМР-тесте на месте пересечения стафилококка и S. agalactiae появляется зона усиления гемолиза в виде «крыла бабочки».

Таблица 3 . Дифференциальные признаки стрептококков

Исследование крови. Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейший ход исследования аналогичен описанному выше.

Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.

13

Серодиагностика (определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопия мазка из чистой культуры Streptococcus pyogenes (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). Клетки стрептококка круглые, располагаются в виде цепочек, по Граму окрашиваются положительно.

2.Микроскопия мазка из чистой культуры энтерококка - Streptococcus faecalis

(демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму). Клетки энтерококка овальные, располагаются в виде коротких цепочек, по Граму окрашиваются положительно.

3.Знакомство с культуральными свойствами стрептококков. На кровяном МПА стрептококки образуют мелкие, мутные, круглые колонии с прозрачной зоной гемолиза вокруг. На сахарном МПБ характерен придонно-пристеночный рост в виде зернистого осадка, среда остается прозрачной.

4.Определение серогруппы (демонстрация реакции латекс-агглютинации с солянокислым экстрактом исследуемой культуры и группоспецифическими сыворотками A,B,C,D), серовара стрептококка (реакция агглютинации исследуемой культуры с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками 5,12, 23).

5..Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций.

-стрептококковый бактериофаг - фильтрат фаголизата стрептококка. Применяется наружно, внутрикожно, внутримышечно для лечения стрептококковых инфекций

Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых гноеродными условно-патогенными грамотрицательными аэробными микроорганизмами.

Бактериоскопический метод (микроскопия мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму). При наличии грамотрицательных бактерий дается предварительный ответ.

Бактериологический метод. Для выделения культуры синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) исследуемый материал засевают в чашки Петри на МПА или на селективную

среду - ЦПХ-агар с цитилпиридиний хлоридом, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. Посевы инкубируют при 370 С в течение суток. Pseudomonas aeruginosa образует круглые, плоские, слизистые колонии. Среда окрашивается в сине-зеленый цвет в результате выработки водорастворимого пигмента – пиоцианина. Палочки окрашиваются по Граму отрицательно, подвижны. Идентификация культур Р.aeruginosa проводится по биохимическим свойствам и образованию пигмента.

Для эпидемиологического анализа госпитальных инфекций определяют серовары Pseudomonas aeruginosa с помощью реакции агглютинации, а также пиоциновары и фаговары.

Выделение энтеробактерий осуществляется путем посева исследуемого материала на одну из дифференциально-диагностических сред для энтеробактерий (Эндо или Левина) с последующим выделением чистых культур и их идентификацией с помощью общепринятых методов. Для выделения бактерий рода Proteus применяют метод Шукевича (посев в конденсационную воду скошенного МПА).

Самостоятельная работа студентов

1.Морфологические свойства Proteus vulgaris (грамотрицательные палочки). Окраска по Граму (демонстрационный микропрепарат).

2.Культуральные свойства Proteus vulgaris (демонстрация) на МПА в чашке Петри (отметить "ползучий" рост на поверхности плотных питательных сред).

3.Ферментативные свойства Proteus vulgaris. (Посев на пестрый ряд Гисса,

демонстрация).

14

4.Морфологические свойства Pseudomonas aeruginosa (демонстрационный микропрепарат). Окраска по Граму (грамотрицательные палочки).

5.Культуральные свойства Pseudomonas aeruginosa на МПА (круглые плоские слизистые колонии с характерным сине-зеленым пигментом и запахом); на МПБ (равномерное помутнение среды и характерное сине-зеленое окрашивание диффундирующим в среду водорастворимым пигментом) (демонстрация).

6.Ферментативные свойства Pseudomonas aeruginosa (Посев на пестрый ряд Гисса,

демонстрация).

Педиатрические аспекты темы

1.Удельный вес стафилококковых заболеваний у детей весьма значителен, особенно у новорожденных и детей раннего возраста, проявляясь в виде стафилококковых пневмоний, энтеритов, сепсиса, остеомиелита и т.д.

2.Поскольку сепсис у детей часто протекает по типу септикопиемии, для увеличения процента бактериологических подтверждений необходимо делать многократно повторные посевы крови, забирая ее у новорожденных детей из вен черепа или из пятки.

3.Наиболее достоверным методом для установления этиологии стафилококковой пневмонии является пункция гнойного очага и плевральной полости с посевом полученного материала на питательные среды с целью выделения чистой культуры стафилококка.

4.Количественный учет микробного обсеменения материала, взятого для исследования, имеет важное значение для установления стафилококковой этиологии энтерита и пневмонии,

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей гнойной и раневой инфекции, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: выполнить микробиологическое исследование с целью диагностики гнойной и раневой инфекции, оценить результаты микробиологических анализов при этих инфекциях.

Тема 2. ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВОЙ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ: АНАЭРОБНОЙ ГАЗОВОЙ ИНФЕКЦИИ, СТОЛБНЯКА. БАКТЕРОИДЫ.

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей раневой анаэробной инфекции, методов ее лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Клостридии. Таксономия. Экология. Биологические свойства. Анаэробиоз. Резистентность к факторам окружающей среды. Факультативный паразитизм и патогенность для человека. Локализация в организме. Токсичность. Генетический контроль токсинообразования.

2.Способы культивирования и методы выделения чистых культур анаэробов.

3.Клостридии раневой анаэробной инфекции. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Факторы патогенности, токсины. Энтеротоксин и его роль при пищевой токсикоинфекции. Патогенез раневой анаэробной инфекции. Роль микробных ассоциаций в патогенезе. Антитоксический иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение и профилактика.

4.Клостридии столбняка. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства. Факторы патогенности, токсины. Патогенез заболевания. Столбняк у новорожденных детей. Антитоксический иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение и профилактика столбняка.

5.Грамотрицательные анаэробные палочки. Бактероиды, фузобактерии, лептотрихии, превотеллы, порфиромонады. Таксономия. Биологические свойства. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика. Этиотропная терапия.

6.Пептококки, пептострептококки, их биологические свойства и роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика инфекции, вызванной анаэробными кокками.

15

7. Анаэробные грамотрицательные кокки – вейлонеллы. Таксономия. Биологические свойства. Факторы патогенности. Роль в патологии человека. Методы микробиологической диагностики.

Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции.

Раневую анаэробную инфекцию у человека вызывают как спорообразующие анаэробные бактерии (Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum), так и неспорообразующие анаэробные микроорганизмы родов Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Veilonella и др.

Методы микробиологических исследований при анаэробной инфекции представлены в схеме 3.

Бактериоскопический метод. Проводится микроскопия окрашенных по Граму, ЦилюНильсену и Гинсу-Бурри мазков, приготовленных из раневого отделяемого, отечной жидкости, некротизированной ткани. Обнаружение в препаратах крупных прямых грамположительных палочек, образующих капсулы и центрально или субтерминально расположенные споры (рис. 3), дает основание поставить предварительный диагноз газовой гангрены. Для экспрессдиагностики применяют прямой метод иммунофлюоресценции.

Схема 3. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций

Материал: кусочки некротизированных тканей, экссудат, гной, отделяемое ран, кровь, секционный материал.

Бактериологический метод. Производят посев исследуемого материала на среды Цейсслера (анаэробный кровяной МПА), Китт-Тароцци, железо-сульфитный агар (ЖСА) и молоко. В молоке через 3-4 часа образуется губкообразный сгусток, погруженный в прозрачную жидкость. На среде Китт-Тароцци через сутки регистрируется помутнение и образование газа, на ЖCA - черные колонии в глубине агарового столбика, на среде Цейсслера – шероховатые (реже

– гладкие), крупные, плоские сероватые колонии с зоной гемолиза. В глубине плотных питательных сред образуются колонии в виде чечевичек, дисков, комочков ваты и т.д. В мазках из колоний обнаруживают крупные грамположительные палочки (рис. 5). Для выделения чистой культуры возбудителей газовой гангрены типичные колонии пересевают на среду Китт-

16

Тароцци и идентифицируют до вида в соответствии с таблицами 4 и 5.

Таблица 4. Биологические свойства неспорообразующих и спорообразующих анаэробов

Обозначения: (+) - постоянный признак, (±) - непостоянный признак, (-) – отсутствие признака, V- вариабельный признак

17

Для обнаружения столбнячной палочки обычно исследуют шовный и перевязочный материал, а в случае неясного течения болезни гной, кровь, кусочки тканей, выделения из матки, секционный материал. Выполняются следующие методы исследования:

Бактериоскопический метод. Не позволяет дать заключение о наличии клостридий столбняка в материале, поскольку в нем могут отсутствовать споры или находиться бактерии, сходные по морфологии с Clostridium tetani.

Бактериологический метод. Клиническая картина столбняка (высокая интоксикация, тонические и клонические судороги) весьма типична, поэтому бактериологическое исследование имеет ограниченное применение. Кроме того, бактериологический метод при столбняке не дает своевременных результатов. Это исследование проводят обычно при неясном течении болезни. Материал для исследования засевают на среду Китт-Тароцци, инкубируют при 370 С в течение 3-4 суток, отмечая придонный рост бактерий. Пересевы осуществляют на сахарный МПА в чашке Петри и в пробирке с последующим выращиванием посевов в анаэростате. Нежные прозрачные колонии пересевают для получения чистой культуры на среду Китт-Тароцци, затем определяют морфологические (прямая палочка с шаровидной спорой на конце в виде барабанной палочки – рис. 6), биохимические свойства (характерна низкая ферментативная активность – табл. 5), токсинообразование.

Самостоятельная работа студентов.

1.Морфологические свойства Clostridium tetani (окраска по Граму). Возбудитель столбняка выглядит в виде прямой палочки с шаровидной спорой, расположенной на конце, напоминая барабанную палочку.

2.Биохимические свойства Clostridium tetani (демонстрация – см. табл. 5).

3.Выявление столбнячного токсина в РНГА. К исследуемому материалу добавлены эритроциты, нагруженные антителами к столбнячному токсину. Положительная реакция характеризуется выпадением осадка эритроцитов с фестончатыми краями.

4.Ознакомление с биопрепаратами, применяемыми для специфической профилактики и терапии столбняка:

- адсорбированный столбнячный анатоксин. Получают путем обезвреживания столб-

нячного токсина формалином. Входит в состав ассоциированной коклюшно-дифтерийно-

19

столбнячной вакцины, дифтерийно-столбнячного анатоксина; выпускается также в виде монопрепарата. Применяется для профилактики;

-противостолбнячная сыворотка. Получают из сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином. Применяют для пассивной профилактики и лечения столбняка;

-иммуноглобулин донорский противостолбнячный. Получен из гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови доноров, ревакцинированных столбнячным анатоксином. Применяется для пассивной иммунизации при экстренной профилактике или для лечения начавшегося заболевания.

Микробиологическая диагностика неклостридиальной анаэробной инфекции

Анаэробную инфекцию могут вызывать не только клостридии, но представители других родов, чаще всего бактероиды (Bacteroides fragilis, другие виды бактероидов, входящих в состав нормальной микрофлоры организма человека), реже - превотеллы, порфиромонады, фузобактерии, пептококки и пептострептококки. Для диагностики инфекции, вызванной бактероидами, применяются следующие методы микробиологического исследования.

Бактериоскопический метод имеет ориентировочное значение и заключается в микроскопии мазков из патологического материала, окрашенных по Граму. Бактероиды – грамотрицательные неспорообразующие полиморфные палочки.

Бактериологический метод. Материал засевают на кровяной агар Цейсслера или селективные среды (кровяной агар с желчью и канамицином), посевы инкубируют при 370 С в бескислородной или газовой атмосфере, состоящей из смеси азота, водорода, кислорода. Через 2-3 дня на поверхности агара образуются небольшие выпуклые серовато-белые колонии с ровными краями. Идентификацию культуры проводят в соответствии с признаками, указанными в табл.4.

Педиатрические аспекты темы

1.Столбняк у детей наблюдается в двух формах: а) травматический столбняк стартах детей, б) столбняк новорожденных. Столбняк новорожденных возникает в результате проникновения столбнячной палочки в пупочную рану в условиях неасептического ухода. Заболевание протекает крайне тяжело с летальным исходом в течение первых 3-5 суток с явлениями пневмонии, диспепсии, тяжелых судорог и сердечных расстройств.

2.При выборе площадки для размещения детского сада и яслей необходимо исследовать анаэробный титр почвы. Показатели, превышающие допустимые санитарные нормы, свидетельствуют о загрязнении почвы анаэробами, среди которых могут находиться и Сlostridium tetani

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей раневой анаэробной инфекции, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: выполнить микробиологическое исследование с целью диагностики раневой анаэробной инфекции, оценить результаты микробиологических анализов при этих инфекциях.

Тема 3. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ: ЧУМЫ, ТУЛЯРЕМИИ, СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных зоонозных инфекций - чумы, туляремии, сибирской язвы, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1.Понятие об особо-опасных, зоонозных, карантинных инфекциях. Правила работы с возбудителями особо-опасных инфекций.

2.Возбудитель чумы, история изучения, биологические свойства. Роль отечественных ученых в изучении чумы. Патогенез, иммунитет, методы микробиологической диагностики и специфической профилактики.

20