1.2.3.3 Типы реакций, применяемых в фотометрии. Требования к ним
В видимой области спектра вещества поглощают электромагнитное излучение либо за счет собственной окраски (калия перманганат, фурацилин, рибофлавин, этакридина лактат и др.), либо за счет образования окрашенных соединений. Образование окрашенных соединений осуществляется с помощью различных типов реакций, к которым предъявляются определенные требования:
- при взаимодействии определяемого вещества цветореагентом должно получиться устойчивое окрашенное соединение, имеющее постоянный состав;
- реакция должна быть стехиометричной;
- реакция должна протекать по возможности быстро;
- она должна быть избирательной и чувствительной;
- используемые реагенты должны быть доступны, безвредны и экономически рентабельны.
Для получения окрашенных соединений используются реакции:
- получения аци-солей с натрия гидроксидом на препараты, содержащие нитрогруппу (фурацилин, фуразолидон, левомицетин, нитроксолин):
- диазотирования с последующим азосочетанием на препараты, содержащие первичную ароматическую аминогруппу (анестезин, новокаин, сульфаниламиды и др.):
- получение гидроксаматов меди и железа для препаратов, содержащих сложноэфирную (новокаин), лактонную (пилокарпин), лактамную (бензилпенициллина калиевая и натриевая соли) группы:
- комплексообразования с железа (ΙΙΙ) хлоридом, железоаммониевыми квасцами (кислота салициловая), с меди (ΙΙ) сульфатом (производные барбитуровой кислоты, глицерин):
- окисление калия перманганатом (кислота фолиевая) и определение образовавшейся п-аминобензоилглутаминовой кислоты реакцией диазотирования с последующим азосочетанием с N-(-1-нафтил)-этилендиамина дихлоридом:
- конденсации с п-диметиламинобензальдегидом (новокаин), с 2,4-динитрофенилгидразином (цитраль):
Если полученное окрашенное соединение нерастворимо в воде, его извлекают органическим растворителем, несмешивающимся с водой (хлороформ, эфир и др.) и определяют оптическую плотность извлечения. Данный вариант фотометрии называют экстракционным. Способом экстракционной фотометрии определяют производные барбитуровой кислоты, эфедрин с меди (ΙΙ) сульфатом, соли органических азотсодержащих оснований, алкалоиды по реакции с кислотными красителями (бромтимоловым синим, пикриновой кислотой, тропеолином 00 и др.) с образованием ионных ассоциатов:
В дифференциальном варианте фотометрии измерение светопоглощения проводится относительно раствора сравнения, содержащего определенное количество анализируемого вещества. В связи с этим дифференциальная фотометрия позволяет повысить точность фотометрических измерений при определении высоких концентраций (10-100%) и уменьшить относительную погрешность анализа до 0,5-1,0%.
1.2.3.4 Стадии фотометрического анализа
1. Подготовка анализируемого образца: взятие навески, разбавление исследуемого раствора до оптимальной концентрации, получение окрашенного соединения.
2. Подготовка одного или нескольких растворов стандартного образца в зависимости от способа расчета концентрации. Если концентрация исследуемого раствора определяется по оптической плотности стандартного раствора, то готовится один стандартный раствор, если же концентрация определяется по калибровочному графику, то готовится серия растворов стандартного образца.
3. Выбор рабочего светофильтра (для фотоколориметрии) и рабочей длины волны (для спектрофотометрии). Вещества характеризуются избирательным поглощением, поэтому оптическая плотность их различна для разных длин волн света. Для полной характеристики исследуемых соединений измеряют их оптическую плотность на спектрофотометре при разных длинах волн, обычно через 5 нм, и, найдя границы с максимальным светопоглощением, вновь измеряют оптическую плотность в этой области через 1 нм. По полученным данным строят кривую светопоглощения (рис.5), откладывая на оси абсцисс значение длин волн (λ) в нм, а на оси ординат значение оптической плотности (D). Длина волны, при которой наблюдается максимальное светопоглощение, обозначается через λmax – это и есть рабочая аналитическая длина волны. Если в спектре несколько максимумов светопоглощения, то обычно выбирают длину волны с максимальным значением оптической плотности.
Рис. 5. Кривая светопоглощения (электронный спектр)
Выбор рабочего светофильтра на фотоэлектроколориметре проводят аналогично, измеряя оптическую плотность исследуемых растворов при различных светофильтрах. Светофильтр, при использовании которого получено максимальное значение оптической плотности является рабочим.
4. Определение толщины фотометрируемого слоя (выбор рабочей кюветы). При выборе кювет следует руководствоваться тем, что минимальная погрешность фотометрических определений имеет место, когда оптическая плотность исследуемого раствора находится в пределах значений 0,2-0,7. Для выбора рабочей кюветы также определяют оптическую плотность раствора при рабочей длине волны или рабочем светофильтре в кювете с толщиной слоя 0,1, 0,3, 0,5, 1,0, 3,0 и 5,0 см. Рабочей считается кювета, при использовании которой оптическая плотность имеет значение в диапазоне 0,2-0,7.
5. Измерение поглощающей способности (оптической плотности) раствора приводится на соответствующих приборах при определенной длине волны или светофильтре и выбранной для анализа кювете.
6. Расчет содержания определяемого вещества и заключение о его качестве в соответствии с требованиями НД.
Современные НД чаще других включают расчеты количественного содержания анализируемого вещества с использованием стандартных образцов.
Стандартные образцы – это вещества, которые используются как эталонные при проведении анализа физическими, физико-химическими или биологическими методами.
Стандартные образцы подразделяются на Государственные стандартные образцы (ГСО), рабочие стандартные образцы (РСО) и стандартные образцы веществ – свидетелей (СОВС).
ГСО выпускаются в соответствии со специальными требованиями, на них, как и на лекарственные вещества имеются специальные фармакопейные статьи. При расчете количественного содержания стандартный образец принимается за 100%.
В качестве РСО используют образцы серийных лекарственных веществ, соответствующие требованиям фармакопейных статей на эти вещества. При расчете количественного содержания определяемого вещества в лекарственной форме учитывают фактическое содержание данного вещества в РСО.
Стандартные образцы веществ-свидетелей (СОВС) используют для определения примесей или компонентного состава лекарственных средств. В качестве СОВС могут быть использованы ГСО, РСО, а также вещества, специально изготовленные и аттестованные в порядке, предусмотренном частной фармакопейной статьей.