1.3.1 Применение уф-спектрофотометрии в фармацевтическом анализе

Благодаря простоте аналитических операций и, в большинстве случаев, высокой чувствительности метод нашел широкое применение в фармацевтическом анализе.

УФ-спектрофотометрия используется при установлении подлинности (идентификации), доброкачественности, количественном определении, как индивидуальных веществ, так и компонентов лекарственных форм; испытании по тестам “Растворение” и “Однородность дозирования”.

Метод применяется на таких стадиях изучения лекарственных веществ и лекарственных форм как фармакокинетика, биодоступность, изучение стабильности и установление сроков годности.

Испытание на подлинность лекарственных веществ. В основе этой стадии фармацевтического анализа лежат следующие приемы:

а) нахождение в спектре λ_max и λ_min , характеризующих области максимального и минимального поглощения;

б) вычисление отношения значений оптических плотностей исследуемого раствора при разных длинах волн;

в) характеристика интенсивности поглощения по величине удельного показателя (Е);

г) сравнение спектра анализируемого вещества со спектром стандартного образца этого же вещества.

Во всех случаях необходимо получение спектра в условиях, приведенных в НД – растворитель, концентрация, интервал длин волн, размер (толщина) кюветы.

Для случая (а) в полученном спектре находят λ_max и λ_min, сравнивают с такими же характеристиками, приведенными в НД – при идентичности веществ оба значения должны совпадать (табл.7).

Удобным приемом при испытании на подлинность является определение отношения величин поглощения при двух максимумах. Это уменьшает влияние переменных характеристик прибора на испытание и исключает необходимость использования стандартного образца. Такой способ используют в случае анализа натрия пара-аминосалицилата натрия

Таблица 7

Характеристика уф-спектров, используемая при идентификации некоторых лекарственных веществ в фармакопейном анализе

№ п/п	Лекарствен-ное вещество	Концентрация и растворитель	Характеристика, используемая для идентификации
1	2	3	4
1	Амлодипина бесилат	0,005% в 1% растворе 0,1 М HClв метаноле	λmax = 360 ± 2нм; Е= 113-121
2	Аминазин	0,0005% в 0,01 М HCl	λmax = 254±2нм, 307±2нм
3	Анестезин	0,0005% в 0,1 М NaOH	λmax = 281±2нм; λmin = 238±2нм
4	Верапамила гидрохлорид	0,002% в 0,01 М HCl	D229 = 0,61 – 0,64 D278= 0,23 – 0,24
5	Дексаметазон	0,001% в 95% спирте	λmax = 240±2нм; D240нм/D263нм= 1,9 – 2,1
6	Дибазол	0,002% в 95% спирте	λmax=244±2нм, 275±2нм, 281±2нм; λmin=230±2нм, 259±2нм, 279±2нм; приведен рисунок спектра
7	Димедрол	0,05% в 95% спирте	λmax=253±2нм, 258±2нм, 264±2нм; λmin=244±2нм, 255±2нм, 263±2нм
8	Дротаверина гидрохлорид	0,0015% в 0,1 М HCl	λmax=241±2нм,302±2нм,353±2нм; λmin=223±2нм,262±2нм,322±2нм
9	Зопиклон	0,001% в 0,1 М HCl	λmax=303±2нм; D303=0,340-0,380
10	Камфора	0,0006% раствор 2,4-динитрофенилгидразона камфоры в 95% спирте этиловом	λmax= 231±2нм, 265±2нм; плечо в области от 273 нм до 277 нм
11	Кислота аскорбиновая	0,001% в буферном растворе с рН 7,0	λmax=265±2нм
12	Кислота никотиновая	0,002% в 0,1 М NaOH	λmax=258±2нм, 264±2нм, 270±2нм; λmin=240±2нм; в области от 240нм до 256нм наблюдаются два неидентифицированных плеча
13	Кислота фолиевая	0,001% в 0,1 М NaOH	Полное совпадение со спектром ГСО в области от 230 до 380 нм
14	Нитроксолин	0,0005% раствор в смеси 95% спирт – буферный раствор с рН 9,18 (98:2)	λmax=249±2нм, 341±2нм, 452,5±2нм; два плеча в области от 228нм до 238нм и от 258нм до 268нм
15	Офлоксацин	0,001% в 0,1 М HCl	λmax= 226±2нм, 295±2нм; λmin= 265±2нм
16	Папаверина гидрохлорид	0,0025% в 0,01 М HCl	λmax= 285±3нм, 309±2нм; λmin= 289±2нм
17	Пирацетам	1% водный раствор	Не имеет выраженных максимумов поглощения в области от 230нм до 350нм
18	Прогестерон	0,001% в 95% спирте	λmax= 241±2нм; Е= 518-545
1	2	3	4
19	Ранитидина гидрохлорид	0,01% водный раствор	λmax= 229±2нм; 315±2нм; D229нм/D315нм= 1,01 – 1,07
20	Сульфа-диметоксин	0,000015% в NaOH 0,000015% в HCl	Спектр щелочного раствора препарата, снятый относительно кислого раствора имеет λmax=253±2нм, 268±2нм; λmin= 260±2нм; Спектр кислого раствора препарата, снятый относительно щелочного раствора, имеет λmax=288±2нм
21	Тамоксифена цитрат	0,002% в метаноле	λmax=237нм, 275нм
22	Фамотидин	0,0025% в фосфатном буфере	Полное совпадение со спектром РСО в области от 230нм до 350нм
23	Фуразолидон	0,0015% в ДМФА	λmax=260±2нм, 367±2нм; λmin=302±2нм
24	Фурацилин	0,0006% в ДМФА	λmax=260±2нм, 375±2нм; λmin=306±2нм

При испытании на подлинность часто рекомендуется рассчитать Ев максимуме поглощения (например, для левомицетина, адреналина, прогестерона) или сравнить найденное значение оптической плотности в определенном диапазоне длин волн со значениями, приведенными в НД. Так спектр поглощения раствора пиридоксина гидрохлорида в фосфатном буферном растворе (рН = 6,9) с концентрацией 0,5 мг/мл в области от 230 до 250 нм имеет максимумы при 254 и 324 нм, а оптическая плотность при этих максимумах равна соответственно 0,18 и 0,35.

Некоторые испытания на подлинность с использованием УФ-спектрофотометрии требуют применение стандартных образцов (СО) лекарственных веществ. В этом случае проба СО должна быть приготовлена и одновременно определена в тех же условиях, что и испытуемое вещество. Так, УФ-спектр 0,0005% раствора этинитэстрадиола в спирте этиловом должен иметь максимумы и минимумы при тех же длинах волн, что и раствор СО одинаковой концентрации, соответствующие величины поглощения, рассчитанные на сухое вещество при λ_max = 281 нм не должны отличаться более, чем на 3%. Такой прием обеспечивает более достоверные результаты, чем при анализе спектра только одного исследуемого соединения.

УФ-спектрофотометрия является также одним из составных комплекса спектральных методов исследования новых биологически активных веществ. Определенные полосы поглощения в спектре могут указать на наличие в структуре этого соединения тех или иных функциональных групп, фрагментов структур (хромофоров). Этим объясняется сходство спектров веществ, содержащих фенильный радикал, например, эфедрина, димедрола, атропина, бензилпенициллина. Они имеют три максимума поглощения: 251, 257 и 263 нм (рис.7).

Лекарственные вещества, содержащие замещенный ароматический радикал – адреналин, морфин, эстрадиол, левомицетин и др. – имеют в спектре один максимум около 260 нм, сопряженную еноновую систему в лекарственных веществах из группы кортикостероидов – около 238 нм (рис.8).

У некоторых лекарственных веществ (производные барбитуровой кислоты, сульфаниламиды, фенолы, некоторые производные пурина и др.) характер спектра может изменяться в зависимости от рН раствора (рис. 9, 10, 11, 12, 14). При этом изменяется λ_max (батохромное смещение), усиливается поглощение (увеличивается величина оптической плотности), наблюдается гиперхромный эффект. Кофеин не проявляет кислотных свойств, поэтому максимум поглощения у него в кислой и щелочной среде при одной и той же длине волны – 272 нм (рис. 13). То есть, УФ-спектрофотометрия может дать информацию об определенных свойствах исследуемого вещества.

Одназначного вывода о структуре химического соединения с помощью УФ-спектрофотометрии сделать невозможно, так как интерпретация спектра затруднена из-за присутствия в молекуле более чем одного хромофора. Тем не менее метод позволяет определить некоторые группировки – хромофоры и сделать вывод о характере и степени сопряжения (с удлинением цепи сопряжения наблюдается смещение максимума поглощения в более длинноволновую область, рис.11).

УФ-спектрофотометрия используется для изучения свойств органических соединений: способности к образованию водородной связи, определения рК_а кислот и оснований, определения состава и свойств комплексных соединений лекарственных веществ, изомерии.

Цис- и транс- изомеры имеют отличные друг от друга спектры. Транс-форма обычно поглощает сильнее и полоса ее поглощения сдвинута в длинноволновую область; этот факт может служить доказательством изменения структуры в ходе реакции.

Однако, УФ-спектры не дают каких-либо сведений о строении исследуемого вещества, т.к. они позволяют установить лишь наличие хромофоров и гетероатомов.

Кроме того, УФ-спектрофотометрия дает прекрасную возможность для количественного анализа веществ, содержащих такие группировки.

При испытании на доброкачественность (чистоту) используют те же характеристики, что и при идентификации. При наличии примесей может изменяться λ_max, появляться дополнительные максимумы, изменяться интенсивность поглощения.

Специфические примеси, присутствующие в лекарственных веществах, как правило, имеют близкое химическое строение с исследуемым веществом. Поэтому особый интерес представляют случаи, когда лекарственное вещество и его специфическая примесь поглощают при разных длинах волн.

Например, λ_max адреналина (Ι) располагается при 278 нм, а его специфическая примесь – адренолон (ΙΙ) имеет максимум поглощения при 310 нм.

Согласно требованию фармакопейной статьи, в 0,05% растворе адреналина, приготовленном для испытания на чистоту, оптическая плотность при 310 нм не должна превышать 0,1 (т.е. в адреналине допускается строго нормируемое содержание адренолона).

Количественное определение. Принцип количественного определения методом УФ-спектрофотометрии заключается в следующем: навеску анализируемого образца (субстанция, лекарственная форма и др.) растворяют в подходящем растворителе, если необходимо, дополнительно готовят разведение полученного раствора и измеряют его оптическую плотность при длине волны, указанной в методике. Концентрацию (содержание) анализируемого вещества находят одним из описанных ранее способов (п. 1.2.3.4).

В соответствии с современными требованиями для таблеток, драже, сухих лекарственных средств для инъекций и лекарственных веществ в капсулах с содержанием действующего вещества 0,05 г и менее обязательным является испытание на однородность дозирования, т.е. содержание вещества в каждой отдельной дозе. Для такой оценки, особенно в случае содержания действующего вещества в мг или его долях (таблетки клофелина содержат 0,075 и 0,15 мг действующего вещества) требуется применение высокочувствительного метода. Таким в большинстве случаев и является УФ-спектрофотометрия.

Актуальным является исследование биодоступности лекарственных веществ. Определенной ее характеристикой является тест “Растворение” (ГФ ΧΙ, вып. 2, с.154). УФ-спектрофотометрия, отличающаяся, как правило, высокой чувствительностью является одним из наиболее часто используемых для этой цели методов (табл.8).

Ниже приводятся методики анализа некоторых лекарственных веществ спектрофотометрическим методом в УФ-области, а в табл.8 приведен ряд примеров использования метода УФ-спектрофотометрии в фармакопейном анализе.