БИОИНЖЕНЕРИЯ
.pdf
Сборка рекомбинантных AAV
• pITR – плазмида, несущая
трансген
• XX680 – аденовирусная плазмида
• pHelper – плазмида-помошник
Тропизм AAV конструкций
AAV плазмида- |
In-vivo тропизм |
помошник (pHelper) |
|
|
|
AAV1 |
Сосудистый эндотелий, мышцы |
|
|
AAV2 |
Мозг, печень, мышцы |
|
|
AAV3 |
Волосковые клетки |
|
|
AAV4 |
Клетки эпендимы и астроциты |
|
|
AAV5 |
Легочные эпителиальные клетки, сетчатка, мозг, ткани |
|
суставов |
|
|
AAV6 |
Мышцы, легкие |
|
|
AAV7 |
Мышцы |
|
|
AAV8 |
Печень, сердце, поджелудочная железа |
|
|
AAV9 |
Сердце |
|
|
AAV10 |
Не известно |
|
|
AAV11 |
Не известно |
|
|
Векторы на основе аденовирусов
Преимущества:
способны инфицировать неделящиеся клетки
большая клонирующая емкость (в настоящее время до 28 т.п.н.)
высокий титр вирионов, выделяемых из упаковочных линий
не встраиваются в геном
Недостатки:
иммуногенность (иммунный ответ развивается через 2-3 инъекции)
кратковременная экспрессия трансгена (не интегрирован в геном)
Векторы на основе ретровирусов
Недостатки:
инфицирование только делящихся клеток
случайное включение в геном
Преимущества:
не иммуногенны
постоянная экспрессия трансгенов (в геноме)
потенциальная РНК-геном канцерогенность
низкий титр вирионов, выделяемых из упаковочных линий
небольшая клонирующая
емкость (до 8 - 10 т.п.н.)
Основные элементы ретровирусов и лентивирусов
Элемент |
Тип плазмиды |
Условия работы |
Назначение |
|
|
|
|
|
|
LTR |
Плазмида для |
in cis |
Представляют собой длинные |
|
концевые повторы. Включает |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
регион U3-R-U5 на каждой |
||
|
|
|
стороне провируса |
|
|
|
|
ретровируса. Клонирующая |
|
|
|
|
емкость между LTR – 8,5 кб. |
|
|
|
|
Однако, вставки более 3 кб |
|
|
|
|
пакуются менее эффективно. |
|
|
|
|
|
|
U3 |
Плазмида для |
in cis |
Уникальный 3΄ регион. |
|
Требуется для активации |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
транскрипции вирусного |
||
|
|
|
генома |
|
|
|
|
|
|
R |
Плазмида для |
in cis |
Повтор, располагающийся |
|
между U3 и U5 в ленти и |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
ретровирусах. Tat |
||
|
|
|
связывающая область. |
|
|
|
|
|
|
U5 |
Плазмида для |
in cis |
Уникальный 5΄ регион. |
|
|
||||
|
переноса трансгена |
|
|
|
|
|
|
|
|
5΄- LTR |
Плазмида для |
in cis |
Действует как промотор РНК- |
|
полимеразы II. Транскрипция |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
запускается с начала региона R |
||
|
|
|
и проходит до конца вирусного |
|
|
|
|
генома. В векторах 3-го |
|
|
|
|
поколения используются |
|
|
|
|
гибридные 5΄- LTR со |
|
|
|
|
встроенным CMV или RSV |
|
|
|
|
|
Основные элементы ретровирусов и лентивирусов
Элемент |
Тип плазмиды |
Условия работы |
Назначение |
|
|
|
|
|
|
TAR |
Плазмида для |
in cis |
Транс-активируемых элемент, |
|
локализующихся в R регионе |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
LTR и являющийся сайтом |
||
|
(в плазмидах 2-го |
|
посадки для Tat. |
|
|
|
|
||
|
поколения) |
|
|
|
|
|
|
|
|
3' LTR |
Плазмида для |
in cis |
Терминирует транскрипцию, |
|
начатую с 5΄- LTR, добавляя |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
полиА хвост сразу после |
||
|
|
|
последовательности R |
|
|
|
|
|
|
cPPT |
Плазмида для |
in cis |
Центральный |
|
полиуридиновый тракт. |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
Является сайтом узнавания для |
||
|
|
|
синтеза ДНК провируса. |
|
|
|
|
Повышает эффективность |
|
|
|
|
трансдукции, а также |
|
|
|
|
экспрессии трансгена. |
|
|
|
|
|
|
Psi (Ψ) |
Плазмида для |
in cis |
Сайт связывания для упаковки |
|
нуклеокапсида |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
RRE |
Плазмида для |
in cis |
Последовательность, с которой |
|
связывается белок Rev |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
|
||
|
|
|
|
Основные элементы ретровирусов и лентивирусов
Элемент |
Тип плазмиды |
Условия работы |
Назначение |
|
|
|
|
|
|
WPRE |
Плазмида для |
in cis |
Пост-транскрипционный |
|
регуляторный элемент вируса |
||||
|
переноса трансгена |
|
||
|
|
гепатита сурков. Данная |
||
|
|
|
||
|
|
|
последовательность |
|
|
|
|
стимулирует экспрессию |
|
|
|
|
трансгена через увеличение |
|
|
|
|
экспорта мРНК из ядра |
|
|
|
|
|
|
Gag |
Пакующая плазмида |
in trans |
Предшественник структурного |
|
белка лентивирусных частиц, |
||||
|
|
|
||
|
|
|
включающий компоненты |
|
|
|
|
матрикса, карсида и |
|
|
|
|
нуклеокапсида |
|
|
|
|
|
|
Pol |
Пакующая плазмида |
in trans |
Предшественник белка, |
|
содержащий компоненты |
||||
|
|
|
||
|
|
|
обратной транскриптазы и |
|
|
|
|
интегразы |
|
|
|
|
|
|
Rev |
Пакующая плазмида |
in trans |
Сайт связывания с RRE для |
|
облегчения выхода из ядра |
||||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
Tat |
Пакующая плазмида |
in trans |
Транс-активатор. Связывает |
|
TAR, чтобы активировать |
||||
|
(для плазмид 2-го |
|
||
|
|
транскрипцию с промотора в |
||
|
поколения) |
|
||
|
|
LTR |
||
|
|
|
|
|
VSVG |
Плазмида, |
in trans |
G гликопротеин вируса |
|
везикулярного стоматита. |
||||
|
кодирующая оболочку |
|
||
|
|
Имеет тропизм к множеству |
||
|
|
|
||
|
|
|
клеток. |
Системы для упаковки лентивирусов
ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ
РЕСТРИКТАЗЫ I ТИПА
•Кодируются тремя генами HSD (Host Specificity
Determinant): hsdR, hsdM, hsdS.
•Система R-M рестиктаз I типа у половины известных бактерий и архей
•53% (1140 из 2145) по крайне мере один ген системы рестрикции I типа
•Рестиктазы I типа представляют собой
пентамерные комплексы: 2R+2M+S
•Для функционирования требуют АТФ, Mg2+, S-
аденозилметионин (SAM)
•Комплексы типа 2M+S обладают только
метилирующей активностью