БИОИНЖЕНЕРИЯ
.pdf
ТРАНСФЕКЦИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Трансфекция с использованием липофильных агентов
МАРКЕРЫ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕСУЩИХ ПЛАЗМИДЫ
НАЗВАНИЕ |
ГЕН, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ |
ТИП КЛЕТОК |
ТИП ДЕЙСТВИЯ |
РАБОЧАЯ |
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ |
КОНЦЕНТРАЦИЯ |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Бластицидин |
bsd |
HeLa, NIH3T3, CHO, |
Ингибирует |
2-10 мк/мл |
(Blasticidin) |
|
COS-1, 293HEK |
терминацию |
|
|
|
|
трансляции |
|
|
|
|
|
|
Генетицин |
neo |
HeLa, NIH3T3, CHO, |
Блокирует 80S |
100-800 мк/мл |
(Geneticin) |
|
293HEK, Jurkat T |
субъединицу |
|
|
|
cells |
рибосомы, |
|
|
|
|
ингибирует |
|
|
|
|
стадию элонгации |
|
|
|
|
|
|
Гигромицин В |
hygB |
HeLa, NIH3T3, CHO, |
Блокирует 80S |
50-500 мк/мл |
(Hygromycin B) |
|
Jurkat T cells |
субъединицу |
|
|
|
|
рибосомы, |
|
|
|
|
ингибирует |
|
|
|
|
стадию элонгации |
|
|
|
|
|
|
Пуромицин |
pac |
HeLa, 293HEK, |
Ингибирует синтез |
1-10 мк/мл |
(Puromycin) |
|
Jurkat T cells |
белка, вызывает |
|
|
|
|
преждевременную |
|
|
|
|
терминацию |
|
|
|
|
|
|
Зеоцин (Zeocin) |
Sh bla |
HeLa, NIH3T3, CHO, |
Формирует |
10-400 мк/мл |
|
|
COS-1, 293HEK, |
комплексы с ДНК, |
|
|
|
Jurkat T cells |
вызывает развыв |
|
|
|
|
цепи |
|
|
|
|
|
|
НЮАНСЫ РАБОТЫ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ ЭКСПРЕССИОННЫМИ ВЕКТОРАМИ
•Не существует общепринятой концентрации антибиотика при работе с клетками млекопитающих! Концентрацию следует подбирать экспериментальным путем.
Чувствительные клетки должны погибнуть в течение 3-5 дней, а устойчивые колонии
сформироваться в течение 10-14 дней, в зависимости от типа используемых клеток (скорости их деления).
НЮАНСЫ РАБОТЫ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ ЭКСПРЕССИОННЫМИ ВЕКТОРАМИ
•Для того, чтобы клетки млекопитающих не проросли бактериями, используют
гентамицин!
•Антибиотик следует добавлять в среду с клетками млекопитающих только спустя 24-
48 часов после трансфекции, когда клетки
«оклемаются»
ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В ДРОЖЖАХ
•Клеточные структуры подобные клеткам растений и животных
•Пост-трансляционная модификация белков
•Особенности культивирования схожи с культивирование прокариот
ОСНОВНЫЕ ДРОЖЖЕВЫЕ ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ
НАЗВАНИЕ |
ХАРАКТЕРИСТИКИ |
|
|
Интегративные плазмиды, YIp (Yeast |
Плазмиды не имеют ORI и должны |
Integrating plasmids) |
интегрироваться непосредственно в |
|
геном через процесс гомологичной |
|
рекомбинации |
|
|
Репликативные плазмиды, YRp (Yeast |
Содержат последовательность для |
Replicating plasmids) |
автономной репликации (ARS, |
|
Autonomously Replicating Sequence). |
|
Реплицируется независимо от генома |
|
дрожжей и имеет склонность к |
|
нестабильности. Количество копий 1-20 |
|
на клетку. |
|
|
Центромерные плазмиды, YCp (Yeast |
Включает часть последовательности для |
Centromere plasmids) |
автономной репликации и часть |
|
центромерной последовательности. |
|
Стабильный вектор – при мейозе |
|
сегрегация по Менделю. Количество |
|
копий 1-2 на клетку. |
|
|
ОСНОВНЫЕ ДРОЖЖЕВЫЕ ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ
НАЗВАНИЕ |
ХАРАКТЕРИСТИКИ |
|
|
Эписомальные плазмиды, YEp (Yeast |
Естественная плазмида дрожжей, |
Episomal plasmids) |
называемая так же 2-х микронная |
|
плазмида. Размер – 6318 пар |
|
нуклеотидов. Содержит ORI, REP1 и REP2 |
|
для репликации, STB для равномерного |
|
распределения между клетками, FLP – |
|
сайт-специфическая рекомбиназа. |
|
Количество копий 50-100 на клетку |
|
|
Дрожжевая искусственная хромосома, |
Содержит центромерный участок и |
YAC (Yeast Artificial Chromosome) |
теломеры на концах хромосомы. |
|
Стабильность возрастает с увеличением |
|
размера вставки. Количество копий 1-2 на |
|
клетку. |
|
|
ДРОЖЖЕВЫЕ ПРОМОТОРЫ
НАЗВАНИЕ ПРОМОТОРА |
СИЛА ПРОМОТОРА |
РЕГУЛЯЦИЯ ПРОМОТОРА |
|
|
|
PGK |
4+ |
20-кратная индукция |
(фосфоглицераткиназный) |
|
глюкозой |
|
|
|
GAL1 |
3+ |
1000-кратная индукция |
(галактокиназный) |
|
галактозой, но репрессия |
|
|
глюкозой |
|
|
|
PHOS |
2+ |
200-кратная репрессия |
(кислой фосфатазы) |
|
фосфатом |
|
|
|
ADH |
2+ |
Конститутивный |
(алкогольдегидрогиназный) |
|
|
|
|
|
CUP1 |
+ |
20-кратная индукция |
(металлотинеиновый) |
|
ионами меди |
|
|
|
MET25 |
+ |
Регулируется |
(метиониновый) |
|
концентрацией |
|
|
метионина |
|
|
|
СЕЛЕКТИВНЫЕ МАРКЕРЫ ДРОЖЖЕЙ
Ауксотрофы — организмы, которые не способны синтезировать определенное органическое соединение, необходимое для роста этого организма
Ауксотрофные организмы выращивают на среде без определенного соединения, таким выживают только те дрожжи, плазмиды в которых кодируют нужный ген
МУЛЬТИЦИСТРОННЫЕ ВЕКТОРЫ
•Ко-трансфекция несколькими плазмидными векторами
•Использование нескольких промоторов
•Использование двунаправленных промоторов
•Создание биили мультицистронных плазмидных векторов