БИОИНЖЕНЕРИЯ

Гены устойчивости к антибиотику

В среднем, в процессе трансформации бактерий, плазмида проникает ли в 1 из 10 тыс. клеток! Выращивание клеток на селективной среде (с антибиотиком) способствует выживанию только тех

клеток, которые содержат плазмиду с геном устойчивости к антибиотику.

Действие антибиотика может быть:

•Бактерицидным – антибиотик убивает бактерии

•Бактериостатическим – антибиотик подавляет рост/деление клеток бактерий

НЕКОТОРЫЕ НЮАНСЫ РАБОТЫ С АНТИБИОТИКАМИ

•Сток должен быть свежим! Большинство антибиотиков хорошо хранится в сухом виде, но быстро деградирует в разбавленном. Разведенный антибиотик нужно хранить на -20 не более 6 месяцев.

•Ампициллин должен храниться не более 1 месяца, так как быстро деградирует.

•Карбенициллин более стабильный нежели ампициллин и может его заменять во многих приложениях.

•Антибиотики чувствительны к теплю и свету! Их нельзя добавлять в среду с температурой выше +55, а так же хранить при свете.

•Некоторые штаммы E.coli уже имеют естественную резистентность к антибиотикам! Необходимо удостовериться,

что вносимая плазмида будет совместима.

НАИБОЛЕЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ АНТИБИОТИКИ

НАИБОЛЕЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ АНТИБИОТИКИ

ТОЧКА НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ (ORI)

•Участок ДНК в точке начала репликации богат A и Т нуклеотидами – там всего две водородные связи и температура плавления ниже, что

способствует более быстрому расхождению цепей

•Контроль репликации плазмид – строгий и ослабленный, как следствие: низкокопийные и

высококопийные плазмиды (cop-сайт - сайт контроля за копийностью)

•Плазмиды могут быть несовместимы (inc-сайт –

отвечает на несовместимость) ДОЛЖНЫ ОТНОСИТСЯ К РАЗНЫМ ГРУППАМ НЕСОВМЕСТИМОСТИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В ОДНОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ!!!

ВОПРОСЫ ВЫБОРА ПЛАЗМИДЫ

•Будет ли плазмида использоваться исключительно в E.coli?

•Будут использоваться грамм-положительные или грамм-отрицательные бактерии?

•Планируется использовать один тип плазмид в ходе конкретного эксперимента?

•Токсичен ли клонируемый ген для клетки в большом количестве?

ВАРИАНТЫ ПЛАЗМИД ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КОЛИЧЕСТВО КОПИЙ ПЛАЗМИД

•ВСТАВКА: бактерии как правило поддерживают плазмиду в меньшем числе копий если в нее клонирован большой по размеру фрагмент ДНК, либо если этот фрагмент кодирует токсичный для клетки продукт

•ОСОБЕННОСТИ ПОДДЕРЖАНИЯ КЛЕТОК: аэрация, температура,

количество, антибиотики, состав среды могут влиять на копийность плазмиды! Некоторые ORI являются чувствительны к температуре, другие – к антибиотику.

•КУЛЬТУРА ПОСЕВА: свеженанесенные бактерии характеризуются большим числом копий плазмид. Для лучшего результата используйте одну колонию, а не субкультуру из раннего стока. Кроме того, инкубирование в течение 12-16 часов также повышает копийность плазмид, ОДНАКО, нужно не пропустить, когда клеточный рост выходит на плато (стационарная фаза) – после этого клетки начинают умирать.

ПРОМОТОР

•Промотор – фрагмент ДНК, ответственный за инициацию транскрипции гена

•Имеет длину в среднем 100-1000 пар оснований и располагается в основном перед геном

•РНК-полимераза не узнает промотор!!! На промотор садятся факторы транскрипции, которые затем рекрутируют полимеразу

БАКТЕРИИ: транскрипция осуществляется одной полимеразой

ЭУКАРИОТЫ: РНК-пол 1 – гены рРНК, 2 – гены мРНК, 3 – гены тРНК и других малых РНК

ТИПЫ ПРОМОТОРОВ ЭУКАРИОТ