Практическая работа

1. Изучить схему классификации видов иммунитета (записать в тетрадь)

2. Изучить основные этапы процесса фагоцитоза (нарисовать стадии фагоцитоза в тетради)

3. Изучить методы оценки фагоцитоза. Изучить методику определения фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа (записать в тетрадь, оформить протокол)

Для постановки опыта берут свежую цитратную кровь и наливают 0,5 мл в стерильную пробирку, туда же добавляют 0,5 мл суточной бульонной культуры стафилококка. Пробирку встряхивают и помещают в термостат на 30 мин при 37°С, после чего из смеси гото­вят мазок. Мазок готовят на чистых обезжиренных предметных стеклах. Пастеровской пипеткой забирают верхний слой клеток над эритроцита­ми, каплю помещают на край предметного стекла, вторым шлифованным предметным стеклом, держа его под углом 45°, быстро проводят по стеклу, распределяя мазок равномерно. Мазок сушат на воздухе, фикси­руют смесью Никифорова 10 мин, окрашивают щелочной метиленовой си­нью 30 секунд, промывают водой, обсушивают и микроскопируют.

Мазки просматривают под микроскопом с иммерсионной системой, считают лейкоциты, как с фагоцитированными стафилококками, так и свободные от них. Подсчитывают не менее 100 клеток. После подсчета проводят расчет показателей фагоцитоза: фагоцитарного индекса (фагоцитарная активность) и фагоцитарного числа (фагоцитарная интенсивность) и др. Для удобства расчета в тетради чертят сетку из 100 квадра­тов, каждый квадрат соответствует лейкоциту. В клетки вписывают ре­зультаты просмотра: 0 – неактивный лейкоцит, цифра в клетке – фаго­цит с количеством поглощенных стафилококков. Фагоцитарный индекс выражается процентом активных лейкоцитов (фагоцитов) к общему числу под­считанных нейтрофильных лей­коцитов.

Например: в просмот­ренном мазке на 100 лейкоци­тов приходится 34 фагоцита – фагоцитарный индекс равен 34%.

0	2	0	4	0	6	9	0	0	0
3	0	2	0	5	0	2	0	6	0
0	4	0	0	4	0	0	0	0	0
5	0	5	0	0	0	0	4	7	0
0	2	0	0	0	0	2	0	0	0
0	0	0	5	0	5	0	0	0	3
0	6	0	0	6	0	0	0	0	0
9	0	6	0	9	4	0	4	4	0
0	5	0	0	0	0	5	2	0	0
0	0	2	0	4	0	0	0	0	0

Фагоцитарное число определяется средним числом фагоцитированных стафилококков, приходящихся на один лейкоцит. Чтобы определить фагоцитарное число, подсчитывают сумму мик­робов захваченных лейкоцитами и делят ее на 100. Например: в просмотренном мазке лейкоцита­ми захвачено 155 стафилококков – фагоцитарное число равно 1,5.

Для оценки полученных данных предложены нормативные критерии (таблица 1).

4. Изучить опсонофагоцитарную реакцию (записать в тетрадь, оформить протокол)

Активность фагоцитоза может быть усилена под действием ан­тител, компонентов комплемента, опсонинов, содержащихся как в нормальной, так и в иммунной сыворотке. Опсонины вызывают повышение чувствительности бактерий к фагоцитозу за счет изменения поверхности микробных тел. Степень активности опсонинов принято выражать опсонофагоцитарным индексом. Опсонофагоцитарный индекс (ОФИ) – это отношение фагоцитарного числа иммунной сыворотки к фагоцитарному числу нормальной сыворотки.

Таблица 1

Нормативные критерии фагоцитоза

Показатель	Фагоцитоз
	Staphylococcus	C.albicans
Фагоцитарный индекс (%)	40–50	40–80
Фагоцитарное число (количество клеток на один нейтрофил)	4–9	1–2,5

Методика постановки и учета ОФИ при заболеваниях различна (визуальная, культуральная, изотопная). При визуальном варианте в пробирку с 0,25 мл 2% раствора цитрата натрия добавляют 0,5 мл крови больного и 0,2 мл специального антигена (культура возбудителя заболевания в определенном объеме) для опсонофагоцитарной реакции (ОФР). Содержимое пробирок перемешивают и 30 минут инкубируют в термостате при 37°С, затем готовят из каждой пробы мазки, фиксируют их и окрашивают метиленовой синькой. Учет результатов производят путем подсчета количества фагоцитированных одним фагоцитом бактерий в учтенных подряд 100 фагоцитах. ОФИ должен быть больше единицы. В клинической практике ОФИ определяют при бруцеллезе, коклюше, дифтерии, риккетсиозах.

5. Ознакомиться с принципом метода хемилюминесценции (записать в тетрадь)

В активированном нейтрофиле (процесс переваривания антигена) происходят мощные мета­болические изменения, сопровождающиеся усилением хими­ческой активности, окислением мембранных компонентов; выделением энергии, хемилюминесценцией – «метаболиче­ский взрыв». Люминол, окисляющийся под влиянием кисло­родных метаболитов, генерирует квант света, который реги­стрируется на хемилюминометре. Система метаболитов активированного кислорода за­нимает основное место в механизмах бактерицидности ней­трофила. Метод хемилюминесценции нейтрофилов исполь­зуется для оценки состояния кислородзависимых бактери­цидных систем нейтрофила. В анализе используется цельная кровь, взятая в про­бирку с антикоагулянтом ЭДТА.

Подготовка к работе хемилюминометра. Включить за 30 мин. до начала исследования. Выставить на панели прибора необходимую температуру (для данной реакции при t = 37°С). При появлении заданной температуры можно при­ступать к анализу. Одновременно с прогревом прибора про­извести программирование опыта:

1. Составить протокол, указать имя файла, меню (контроли положительные, отрицательные), список пациентов, фор­мулу расчета, работу диспенсеров, дозу ФМА;

2. Подготовить образцы пациентов к исследованию. Образ­цы цельной крови внести в пластмассовые пробирки хе­милюминометра (реакционные пробирки), разбавить их в соотношении 1:100 раствором Хенкса (2 мкл крови и 200 мкл раствора Хенкса);

3. Приготовить контрольные образцы:

- 1-я пробирка – хемилюминесцентная пустая (бланк),

- во 2-ю пробирку внести 400 мкл раствора Хенкса,

- в 3-ю пробирку внести 200 мкл раствора Хенкса и 200 мкл рабочего раствора люминола (2-я и 3-я про­бирки являются контролем неспецифической хеми­люминесценции).

Техника постановки анализа:

1. Перенести пробирки с образцами и контрольным мате­риалом в прибор. В первые три гнезда поставить кон­трольные пробирки, в остальные – разведенные образцы цельной крови пациентов;

2. Включить сигнал «старт» прибора. На этом этапе реакции через 20 – 40 мин. определяется спонтанная хемилюминес­ценция (адгезия – прикрепление клеток крови к стенкам пробирок);

3. После окончания времени спонтанной хемилюминесцен­ции в автоматическом режиме в каждую пробирку пода­ется 50 мкл рабочего раствора ФМА, являющегося сти­мулятором. Затем в кинетическом режиме фиксируется активность стимулированного (индуцированного) нейтрофила – индуцированная хемилюминесценция;

4. По окончании реакции результаты автоматически распе­чатываются (запрограммированные показатели: спонтан­ная или индуцированная хемилюминесценция). Определяется также индекс стимуляции – отношение процента положи­тельных клеток в индуцированной XЛ к проценту поло­жительных клеток в спонтанной XЛ. Спонтанная хемилюминесценция свидетельствует о «метаболическом взрыве», возникающем в нейтрофиле в свя­зи с фагоцитозом. При стимуляции активность нейтрофилов возрастает. Индуцированная (стимулированная) хемилюминесценция характеризует резервы бактерицидной функции нейтрофи­лов. В комплексе с другими – ме-тод определения фагоцитоза позволяет прогнозировать течение за-болевания и оценивать эффективность терапии.

Контроль качества:

- оценить данные результатов контрольных проб;

- внести значения контрольных материалов на построенной карте Шухарта, при каждой постановке анализа;

- оформить бланки направлений пациентов.

У здоровых лиц значения хемилюминесценции (XЛ) соответствуют (табл.2):

Таблица 2

Исследуемый материал	Спонтанная ХЛ	Индуцирован­ная ХЛ	Индекс сти­муляции (ИС)
кровь (1:100) усл. ед.	0,3–1,5	1,7–50,0	>5,0
популяция нейтро­филов (усл. ед.)	1–7	7–50	>9

6. Изучить метод НСТ (записать в тетрадь, оформить протокол)

НСТ – тест основан на способности нейтрофи­лов поглощать тетразолий синий (НСТ) и восстанавливать его в гранулы нерас­творимого диформазана. Восстановление НСТ обеспечивает­ся энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций «метаболического взрыва», сопровождающего про­цесс фагоцитоза, а также повышенного метаболизма активи­рованного нейтрофила.

Техника постановки анализа

В две пробирки внести по 0,1 мл гепаринизированной крови или лейковзвеси и добавить по 0,1 мл инкубационной смеси: в 1-ю пробирку внести 0,1 мл ФСБ (спонтанный НСТ-тест); во 2-ю – 0,1 мл взвеси зимозана (250 мкг/мл) или декстрана сульфата (300 мкг/мл) – стимулированный НСТ-тест. Пробирки инкубировать 20 мин. при t 37°С, затем центри­фугировать и из осадка сделать мазки. Мазки высушива­ют, фиксируют 5 мин. метанолом, докрашивают в течение 10 мин. ядра 2% метиловым зеленым или 1% сафранином.

Учет результатов.

Подсчитывается 100 нейтрофилов и вычисляется про­цент клеток, содержащих включения диформазана в виде гранул или сплошных отложений; рассчитывается средний цитохимический коэффициент (СЦК) по формуле Астальди-Верга. Для этого клетки делятся на четыре группы по коли­честву гранул диформазана:

- с нулевой активностью (гранул нет) – 0;

- со слабо положительной реакцией (единичные гранулы) – 1+;

- с положительной реакцией (гранулы покрывают 50% площади цитоплазмы) – 2++;

- с резко положительной реакцией (более 50% площади ци­топлазмы занято гранулами) – 3+++;

Для подсчета удобно пользоваться лабораторным счетчиком клеток:

- на 1-й клавише откладываются отрицательные клетки; (а

- на 2-й клавише – со слабой реакцией; (b)

- на 3-й клавише – с положительной реакцией; (с)

- на 4-й клавише – с резко положительной реакцией, (d)

В сумме (а+в+c+d) = 100, тогда процент положитель­ных клеток (в+c+d) = 100 - а%.

Средний цитохроматический коэффициент (СЦК) = (1хв +2хс + 3хd) / 100.

Вычисляется индекс стимуляции (ИС):

ИС = процент полож. клеток в стимулированном НСТ тесте процент полож. клеток в спонтанном НСТ тесте

Контроль качества

Оценка результатов. В норме у здоровых людей процент нейтрофилов, спонтанно восстанавливающий НСТ до диформазана, не превышает 10%. В норме число НСТ по­ложительных нейтрофилов в результате стимуляции возрас­тает до 40–80%, индекс стимуляции составляет 5–10. Снижение показателей НСТ-теста указывает на уменьшение спонтанной и стимулированной фагоцитарной и бактерицидной функций. Это может быть обусловлено пато­логией самих нейтрофилов или дефицитом гуморальных факторов, обеспечивающих нормальный фагоцитоз.

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

Практическое занятие 2

ТЕМА. Неспецифические факторы защиты. Гуморальные неспе-цифические факторы защиты. Опреде­ление уровня лизоцима методом диффузии в агаре. Систе­ма комплемента. Методы определения комплемента в сыворотках крови. Общая гемолитическая активность ком­племента. Определение СЗ компонента комплемента

Цель занятия. Изучить механизмы неспецифической гуморальной защиты человека, методы их оценки