Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме: «Специфическая профилактика при бактериальных и вирусных инфекциях» – 80 мин

1. Основные механизмы гиперчувствительности замедлен­ного типа

2. Принцип реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). Значение метода

3. Техника постановки РТМЛ

4. Определение понятий вакцины

5. Вакцинопрофилактика, вакцинотерапия

6. Типы вакцин, получение

7. Национальный календарь прививок

8. Календарь прививок по эпидемиологическим показаниям

9. Формирование поствакцинального иммунитета

10. Противопоказания к прививанию

11. Реакция флоккуляции

4. Выполнение практической работы – 30 мин

Практическая работа

1. Изучить механизм развития ГЗТ по схеме (зарисовать)

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). Это IV тип аллергии, чаще развивается: на простые химические вещества гаптенной природы; на микробные аллергены при хронических процессах; на лекарственные аллергены; на собственные измененные клетки. Фаза сенсибилизации представляет собой формирование иммунного ответа по клеточному типу. В организме накапливаются антигенспецифические СД4 лимфоциты. Прототипом ГЗТ является реакция Манту.

2. Изучить реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) (записать в тетрадь, оформить протокол)

Изучение антигенспецифической активации лимфоцита – эффектов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) – позволяет проконтролировать спонтанную подвижность фа­гоцитов, циркуляцию, накопление фагоцитов в зоне воспале­ния и мобилизацию защитных свойств этих клеток in vivo.

Реакция торможения миграции лимфоцитов (PTMЛ) периферической крови играет важную роль для оцен­ки специфического клеточного иммунитета различных заболеваний.

Принцип метода. В присутствии специфического ан­тигена предварительно сенсибилизированные лимфоциты выде ляют фактор (лимфокин), тормозящий миграцию лейко­цитов.

В реакциях могут использоваться лейкоцитарная сус­пензия (по Бейому) и капиллярная кровь.

Техника постановки анализа:

- в лунки плоскодонного планшета внести по 200 мкл культуральной среды (контроль) и по 200 мкл раствора митогена (ФГА);

- в пробирку с гепарином (20 ЕД гепарина/мл крови) взять кровь из пальца или из вены;

- через 30–40 мин. собрать лейковзвесь в чистую центри­фужную пробирку; довести объем лейковзвеси ФСБ до 10 мл и отцентрифугировать 7–10 мин при 1000 об/мин;

- супернатант удалить, а осадок тщательно ресуспендиро­вать в объеме в 2–3 раза меньше исходного;

- установить аппаратик для РТМЛ на плоскодонный план­шет. Взять чистые наконечники и пипетку на 5 мкл. Бы­стро наполнить наконечники лейковзвесью и аккуратно вставить в лунки планшета, заполненные культуральной средой и различными концентрациями аутоантигена;

- планшет, установленный на горизонтальном столике, ин­кубировать 1 ч;

- после инкубации снять аппаратик, закрыть планшет крышкой и поместить в инкубатор (при 37°С атмосфера СО₂) на ночь.

Учет реакции проводить на следующий день с по­мощью микроскопа. Измерить диаметр миграции в контроле и в опытных образцах. Подсчитать индекс миграции (ИМ) для используемых концентраций аутоантигенов:

ИМ= Д²опыт

Д²контр.

Индекс миграции <0,85 и >1,15 указывает на сенсиби­лизацию Т-лимфоцитов. По индексу миграции лимфоцитов можно выбрать дозы аутоантигенов, на которые реагируют только лимфоциты пациентов. Учет РТМЛ позволяет прово­дить скрининговые исследования на аутоиммунную патоло­гию.

Контроль качества проводится по общепринятым мето­дам (см. предыдущие занятия).

Можно использовать другой метод определения РТМЛ.

3. Изучить постановку РТМЛ капиллярным методом (записать в тетрадь, оформить протокол)

Капиллярный вариант РТМЛ – наибо­лее распространен в клинической иммунологии.

Постановка опыта. Капилляры определенного диа­метра плотно заполняют лейкоцитами крови, вводя в них суспензии клеток с последующим центрифугированием. Ан­тигены (бактерии, вирусы, грибы и др.) добавляют к суспен­зии клеток или в среду инкубационных камер. Капилляры помещают в камеры, содержащие среду 199 и инкубируют 18–24 ч при t = 37°С. За это время лейкоциты мигрируют из капилляра, образуя зону помутнения. При наличии сенсиби­лизации к антигену лимфоциты синтезируют фактор, тормо­зящий миграцию лейкоцитов. Измеряют площадь этой зоны.

Учет реакции проводится по величине площади миграции в опыте и в контроле (без антигена). Реакция может прово­диться в слое агарозы. Индекс миграции (процент миграции) рассчитывается по формуле: ср. площадь миграции лим­фоцитов с антигеном / ср. площадь миграции без антиге­на х 100, выражается в процентах. Положительной считается проба с индексом миграции менее 80%. Чем выше сенсиби­лизация, тем больше торможение миграции, и, соответствен­но, ниже процент индекса миграции. Торможение миграции более 20% считается положительным.

Метод позволяет без кожных проб определить сенси­билизацию лимфоцитов человека к различным аллергенам и антигенам.

4. Изучить биологические препараты (записать в тетрадь, оформить протокол)

При изучении препаратов студент обращает внимание на:

- внешний вид препарата;

- из инструкции записывает, что содержит препарат, как он получен;

- какое биологическое действие на организм оказывает;

- с какой целью препарат в организм вводится;

- как препарат вводится в организм.

Обращает внимание на перечень обязательных сведений, которые указаны на этикетке:

- наименование препарата;

- номер государственного контроля;

- номер серии препарата;

- срок годности;

- срок вакцинации и ревакцинации.

Биологические препарат представляют собой вид продукции к производству и контролю, которой предъявляются особо жесткие требования. Эти требования обеспечивают безвредность, надежность и стандартность препарата для прививаемых.

Контроль препаратов осуществляется на всех этапах производства, кроме того, проводится полный дополнительный контроль в специальном подразделении – отделе биологического контроля, после заключения, которого препараты выпускаются для практического применения.