Практическая работа

Изучить реакции иммунитета при вирусных инфекциях

1. Изучить реакцию нейтрализации вируса (записать в тетрадь, оформить протокол).

Реакция нейтрализации вируса основана на способности проти­вовирусных антител погашать инфекционное действие вируса.

Источником вируса в реакции служат жидкости и экстракты инфицированных культур клеток, куриных эмбрионов, органов зараженных животных. Вируссодержащий материал освобождают от крупных, частиц, гомогенизируют и титруют для выяснения его биологической актив­ности. Источником антител служат иммунные сыворотки или парные сыворотки больных. Реакция нейтрализации широко используется в диагностике вирусных инфекций, как для обнаружения антител, так и для определения типа выделенного вируса.

Нейтрализующее действие антител можно обнаружить в опытах на животных. Для этого вируссодержащий материал смешивают с сывороткой, выдерживают смесь 1–2 часа и вводят животным. Если вирус нейтрализован антителами, животное не погибает.

Реакцию нейтрализации (схема 14) можно поставить в культуре ткани. В этом случае реакцию ставят тремя способами: 1) с учетом результа­тов по цитопатогенному эффекту; 2) методом цветной пробы; 3) по гемадсорбции.

Для постановки реакции по цитопатогенному эффекту готовят разведения вируса, кратные десяти, для определения титра вируса и заражают однослойную культуру ткани. Через 5–7 дней клеточный слой разрушается, за титр вируса принимают то его наибольшее разведение, которое вызывает дегенерацию 50% клеток. После этого разведения сыворотки смешивают с ранними объемами вируссодержащего материала в определенной дозе и после часовой экспозиции эту смесь вносят в пробирки с однослойной культурой ткани. Опыт сопровождается контролями: роста вируса, жизнеспособности клеток. Все пробирки помещают в термостат при 37°С, ежедневно просматривают пробирки, через 4–6 суток учи­тывают результат. В опытных пробирках вирус будет нейтрализован антителами, и клетки культуры ткани будут нормальными, в контроле вируса произойдет дегенерация клеток. Титр сыворотки – это наибольшее разведение сыворотки, которое предотвращает дегенера­цию клеток. Тип вируса определяют по типоспецифической сыворотке, предупреждающей развитие дегенерации и культуре ткани.

2. Изучить цветную пробу (записать в тетрадь, оформить протокол)

Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток. Это определяют по цвету индикатора, содержащегося в питательной среде. В незараженных клетках выражен метаболизм, выделяются кислые продукты в пи­тательную среду, изменяя рН в кислую сторону и индикатор фенолрот из красного становится желтым. При заражении клетки вирусом в ней происходят дегенеративные изменения, активность метаболизма подавляется, цвет индикатора остается красным (не меняется). Специфические сыворотки, взаимодействуя с вирусом, нейтрализуют его, клетки остаются жизнеспособными, метаболизм не подавлен, рН сдвигается в кислую сторону, среда желтеет.

Реакцию ставят на перевиваемых культурах клеток: HЕP-2, СОЦ, НЕLА и др.

Реакцию цветной пробы применяют для идентификации и дифференциации выделенных вирусов (таблица 14). Предварительно вирус титруют, опре­деляют цитопатическую дозу. Для этого готовят разведения вируссодержащего материала, кратные 10, и определенный объем каждо­го разведения смешивают с равным объемом клеток в определенной дозе. После 5-суточного инкубирования при 37°С реакцию учитывают, определяют титр вируса. За титр вируса принимают то его наибольшее разведение, при котором наблюдается подавление метаболизма клеток (цвет индикатора в среде не изменяется). В качестве антигена используют вирусный диагностикум.

Таблица 14

Схема проведения цветной пробы

Ингредиенты	1	2	3	4	5	6	7	8
							контроль
Сыворотка больного №1 в разведениях	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	с-ки	клеток
	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25 1:10	-
Питательная среда	-	-	-	-	-	-	0,25	0,25
Вирусный диагностикум одного из типов по 100 ЦПД50 на пробирку	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	-
Взвесь клеток 300-400 тыс/мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Вазелиновое масло	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4

После определения титра вируса смешивают определенную его дозу с типоспецифической противовирусной сывороткой, инкубируют 1 час при комнатной температуре, и этой смесью заражают взвесь клеток культуры ткани. Опыт сопровождается контролями. Все пробир­ки инкубируют в термостате от 4 до 9 дней. Изменение цвета индикатора в желтый говорит о нейтрализации вируса соответствующими антителами и позволяет определить вид вируса. Сохранение исходного цвета индикатора говорит о несоответствии вируса типу антител сыворотки.

Цветная проба для определения антител в сыворотке крови больных людей. Используются парные сыворотки для обнаружения прироста антител. Первую сыворотку берут в первые дни заболевания, вторую – на 15–20 день от начала заболевания. Сыворотки исследуют одномоментно, перед постановкой реакции сыворотки прогревают при 56–60°С в течение 30 мин для разрушения термолабильных ингибиторов.

Титрование антител в сыворотке №2 проводят аналогично.

Через 4–6 суток просматривают пробирки, учитывают результат и определяют титр сыворотки. За титр сыворотки принимают то ее наибольшее разведение, которое полностью нейтрализует вирус. Его определяют по пробирке с наибольшим разведением, окрашенным в желтый цвет. Рассчитывают прирост антител в сыворотке №2 по сравнению с сывороткой №1. Достоверным является увеличение титра антител не менее чем в 4 раза.

3. Изучить реакцию гемагглютинации (РГА) для определения титра вируса по схеме (записать в тетрадь, оформить протокол)

Перед постановкой РТГА определяют дозу вируса, которая соответствует четырехкратному увеличению титра – 4 АЕ.

Титр вируса определяют в реакции гемагглютинации. За 1 АЕ принимают максимальное разведение вируса, дающее гемагглютинацию не менее чем на два плюса. Пластину встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Учитывают результат, определяют 1АЕ и рассчитывают 4 АЕ. Например: 1 АЕ = 1:32, 4 АЕ равно 1:8 (таблица 15).

4. Изучить реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) для типирования вируса (записать в тетрадь, оформить протокол)

Реакция торможения гемагглютинации основана на способности противовирусных антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вирусов. Реакцию ставят в развернутом ряду, используя пластины из органического стекла с лунками.

Реакцию торможения гемагглютинации ставят с типоспецифическими диагностическими противовирусными сыворотками (таблица 16). Пластину встряхивают и оставляют при комнатной температуре до оседания эритроцитов в контроле. Учитывают результат. При соответствии типа вируса антителам произойдет торможение гемагглютинации, и осадок эритроцитов будет выглядеть так же, как в контроле сыворотки – в виде «пуговки». Если вирус не соответствует антителам, произойдет гемагглютинация, и осадок эритроцитов будет выглядеть так же, как в контроле вируса – в виде «зонтика». По проведенному исследованию делают заключение о типе выделенного вируса.

С другими типоспецифическими сыворотками реакция ставится аналогично.

Таблица15

Схема РГА

№№ пробирок	1	2	3	4	5	6
Разведения аллантоисной жидкости	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	контроль
Физиологический раствор	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-
Аллантоисная жидкость, разв. 1:2	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25 0,25	в дез.р-р -
1% куриные эмбрионы	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Учет гемагглютинации					-	-

5. Изучить РТГА для определения прироста антител в сыворотках больных (записать в тетрадь, оформить протокол)

В качестве антигена используют стандартные диагностикумы, представляющие собой взвесь эталонных штаммов вируса различных серологических типов. Диагностикум предварительно титруют, определяют 4 АЕ. В качестве антител используют парные сыворотки больных. Сыворотки разводят, к каждому разве­дению сыворотки крови больного, взятой в острый период и в период реконвалесценции, прибавляют равный объем диагностикума в титре 4 АЕ, пластины встряхивают, оставляют на 30 мин. при комнатной температуре, после чего добавляют по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. Пластину встряхивают и оставляют на 45 мин. при комнатной температуре, после чего учитывают результат. Определяют титр сыворотки №1 и №2. Наибольшее разведение сыворотки, которое тормозит гемагглютинацию эритроцитов является титром сыворотки (табл.16). Четырехкратное и более увеличение титра антител в сыворотке реконвалесцентов свидетельствует о связи перенесенной болезни с данным вирусом.

Таблица 16