Методические указания к практической работе

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме: «Реакции бактериолиза, гемолиза. Реакция связывания комплемента (РСК)» – 70 мин

1. Реакция бактериолиза (феномен Исаева-Пфейффера)

2. Реакция гемолиза, характеристика компонентов, практическое использование

3. РСК, характеристика компонентов, участвующих в РСК, практическое использование

4. Выполнение практической работы – 40 мин

Практическая работа

1. Изучить методику титрования комплемента по схеме (зарисовать, записать в терадь)

В качестве комплемента используется свежевзятая или консервированная сыворотка морской свинки, разведенная 1:10. Титр комплемента определяется в реакции иммунного гемолиза. Берут ряд пробирок, в которые разливают комплемент (1:10) в объеме от 0,05 до 0,5 мл, после чего объем в каждой пробирке доводят до 0,5 мл физиологическим раствором. Пробирки помещают в термостат на 45 мин. Одновременно готовят гемолитическую систему, состоящую из равных объемов гемолитической сыворотки в рабочем титре и 3% взвесь бараньих эритроцитов. Приготовленную систему по 1,0 мл добавляют в пробирки с комплементом. Параллельно ставят контроль гемолитической системы и комплемента. Все пробирки помещают в термостат на 30 мин, после чего определяют титр комплемента.

Под титром комплемента понимают то его наименьшее количество, т.е. наибольшее разведение, которое вызывает полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов.

2. Изучить методику титрования гемолитической сыворотки по схеме (записать в тетрадь)

Гемолитическую сыворотку готовят путем гипериммунизации кролика эритроцитами барана. При титровании гемолитическую сыворотку разводят от 1:1000 до 1:4500. Приготовленные разведения по 0,5 мл разливают в пробирки, туда же приливают по 0,5 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов и 0,5 мл комплемента в рабочей дозе. Объем жидкости в каждой пробирке доводят до 2,5 мл физиологическим раствором. Параллельно ставят контроли гемолитической системы и эритроцитов. Пробирки помещают в термостат на 1 час, после чего учитывают результат и определяют титр гемолитической сыворотки.

Под титром гемолитической сыворотки понимают то ее наибольшее разведение, 0,5 мл которого вызывает полный гемолиз 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии рабочей дозы комплемента.

3. Изучить методику постановки реакции связывания комплемента (РСК, реакция Борде-Жангу) (записать в тетрадь, оформить протокол)

Реакция связывания комплемента основана на способности комплемента полностью или частично адсорбироваться на комплексе антиген+антитело. Адсорбция комплемента на комплексе антиген+антитело визуально не проявляется, т.е. видимого комплекса не образует. Для того чтобы установить, произошла адсорбция комплемента или он остался свободным, в реакцию вводится вторая система – индикаторная, гемолитическая. Она состоит из антигена (эритроцитов барана) и антител (гемолитическая сыворотка).

Если комплемента в растворе нет, так как он адсорбировался на комплексе антиген+антитело в первой части реакции, гемолиза во второй части реакции не будет, эритроциты осядут на дно пробирки, реакция положительная. Если же комплемент остался в растворе, так как нет взаимодействия между антигеном и антителами в первой части реакции, то наступает гемолиз эритроцитов, образуется «лаковая кровь», реакция отрицательная.

РСК характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Она может быть применена для диагностики почти всех инфекционных заболеваний, как для обнаружения антигена, так и для определения антител. Сложность постановки реакции обусловлена количеством вводимых компонентов, необходимостью определять точные количественные соотношения.

Исследуемая или свежее взятая иммунная сыворотка перед опытом подвергается прогреванию при 56°С в течение 30 мин для инактивации, т.е. разрушения собственного комплемента. После инактивации сыворотку разводят 1:5.

Антиген готовят или из культур микробов или органов инфицированного или здорового животного. Антиген титруют и определяют то его количество, при котором отсутствует тормозящее на комплемент действие.

Комплемент титруют и определяют его рабочую дозу. Рабочая доза комплемента – это количество комплемента, увеличенное против титра на 25–30%. Это необходимо потому, что активность комплемента может быть несколько подавлена другими ингредиентами.

Гемолитическая сыворотка титруется, для постановки реакции используют сыворотку, усиленную против титра в 3–4 раза. Например, если титр сыворотки 1:1800, то в реакции применяют разведение 1:600.

Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированой крови, их отмывают, центрифугируя трижды с новыми порциями физиологического раствора, а потом готовят 3% взвесь.

Из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки готовят гемолитическую систему, смешивая равные объемы сыворотки и эритроцитов.

Только после подготовки всех компонентов ставят основной опят РСК. Реакция состоит из двух фаз, каждая из которых представляет самостоятельную иммунологическую реакцию, требующую определенных постоянных условий для своего проявления. Общепринятой является методика проведения реакции в 1 фазе в течение одного часа при 37°С, во второй фазе – в течение 30–60 мин при 37°С. Оттитрованные компоненты разводят физиологическим раствором так, чтобы рабочая доза их содержалась в объеме 0,5 мл.

Реакцию ставят с одним (полуколичественный способ) или несколькими (количественный способ) разведениями сыворотки, добавляя компоненты в следующем порядке: разведенная инактивированная сыворотка, антиген, рабочая доза комплемента, гемолитическая система по схеме (таблица 12):

Таблица 12

Схема постановки РСК

Компоненты реакции	1	2	3	4
Инактивированная сыворотка 1:5	0,5	0,5	-	0,5
Антиген в рабочей дозе	0,5	-	0,5	0,5
Комплемент в рабочей дозе	0,5	0,5	0,5	-
Физиологический раствор	-	0,5	0,5	0,5
В термостат при 37°С на один час
Гемолитическая система	1,0	1,0	1,0	1,0
В термостат при 37°С на один час

Учет через 24 часа.

Интенсивность реакции оценивают по 4-х балльной системе плюсами:

(++++) – полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, жидкость над ними не окрашена, прозрачная

(+++) – неполная задержка гемолиза, осадок эритроцитов значительный, жидкость над эритроцитами слабо-розоватого цвета

(++) – частичная задержка гемолиза, жидкость красная, осадок эритроцитов

(+) – слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно красная, незначительный осадок эритроцитов

(±) – следы задержки гемолиза, гемолиз почти полный, при взбалтывании со дна поднимается незначительный осадок в виде облачка

(-) – полный гемолиз, осадок отсутствует.

Таблица 13

Схема учета РСК

№ пробирок	1	2	3	4
Результат	полная задержка гемолиза	гемолиз	гемолиз	отсутствие гемолиза

Заключение РСК ........................

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

Практическое занятие 10

Тема. Гуморальный и клеточный иммунный ответ. Взаимодействие клеток при реализации иммунного ответа. Переработка, транспортировка и представление антигена специализированными антигенпредставляющими клетками иммунной системы, их характеристика (дендритные клетки, моноцитарно-макрофагальные, В-лимфоциты, другие клетки). Феномен двойного распознавания, характеристика, значение в иммунологии. Современные методы оценки способности иммунокомпетентных клеток к распознаванию, активации, пролиферации, дифференцировке, регуляции

Цель занятия. Ознакомить студентов с гуморальным и клеточным иммунным ответом