Вирусология общая Горячкиной

сомнения в бактерилогической стерильности и ссл е д у е м о й вируссодержащей надосадочной ж идкости, к ней добавля­ ют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микро­ организмы. А нтибиотики не влияют на вирусы, и они со­ храняют свою ж изнеспособность. Применяют пенициллин и стрептомицин (200 -1000 ЕД/мл) и нистатин (20 ЕД/мл). В настоящее время в связи с большим распространением штаммов, резистентных ко многим антибиотикам, пред­ почитают использовать различные антибиотики ш ироко­ го спектра действия и их сочетания (например, тетрацик­ лин, оксациллин, гентамицин и др.). Как правило, доста­ точно 3 0 -60 минут контакта для бактерицидного действия, но, тем не менее, необходим посев материала на пита­ тельную среду для контроля на бактериологическую сте­ рильность. Освобож дённую от посторонней микрофлоры вируссодерж ащ ую ж идкость используют для дальнейших исследований.

Концент рация вирусов. Если предполагают, что иссле­ дуемый материал содержит малое количество вирусов, его подвергают предварительной концентрации путём двукрат­ ного центрифугирования: сперва при 2000 -3000 об/мин в течение 20 минут осаждают крупные частицы, а затем содерж ащ ую вирусы надосадочную ж идкость подвергают ультрацентрафугированию при 40000 об/м ин в течение часа и получают желеобразный осадок, где сконцентри­ рованы вирусы .

Примеры взятия и обработки некоторы х часто иссле­ дуемых материалов от больных вирусными инфекциями:

-Смыв из носоглотки. Больной прополаскивает рот (утром до приёма пищи и лекарств) стерильным фи­ зиологическим раствором или раствором Хенкса в объеме 10 мл. Смыв помещ ают во флакон и достав­ ляют в лабораторию в термосе со льдом. Далее смыв центрифугируют при 2000 об/м ин в течение 15 ми­ нут, к полученной надосадочной ж идкости добавля­ ют антибиотики, и через 30—60 минут материал го­ тов для дальнейшего исследования.

-Испражнения в количестве 2 -5 г помещ ают во фла­ коны, закрывают резиновыми пробками и доставля­ ют в лабораторию в термосе со льдом. В лаборатории пробу разводят 1:10 раствором Хенкса, гомогенизи­

руют в баночке с бусами путём встряхивания, затем проводят центрифугирование при 2000 -3000 об/м ин в течение 30 минут. К надосадочной ж идкости добав­ ляют антибиотики в значительной концентрации. После 3 0 -6 0 минутного контакта проводят высев в бульон для бактериологического контроля на стериль­ ность.

До получения ответа надосадочную ж идкость сохраня­ ют в замороженном состоянии, а затем использую т её для выделения вируса.

Методы очистки вирусов

Для проведения некоторы х вирусологических исследо­ ваний, например, электронном икроскопических, а также для изучения физикохимических свойств вирусов, необ­ ходимо иметь их вы сокоочищ енны е препараты, не содер­ жащие посторонних примесей. Такой очистке подверга­ ют вируссодержащие материалы, предварительно сконцен­ трированные путём двукратного центрифугирования при различных скоростях. Дополнительную очистку осущ е­ ствляют различными физико-химическими методами.

Дифференциальное центрифугирование. Метод разде­ ления частиц разных размеров по различной скорости их осаждения. При этом методе многократно чередуется ма­ лая (2000-3000 об/м ин ) и большая (40 00 0 -50 0 00 об/м ин ) скорости центрифугирования вируссодерж ащ его матери­ ала. Вирус оказывается то в надосадочной ж идкости (при малых скоростях), то в осадке (при больш их скоростях), который ресуспензируют и снова подвергают центрифу­ гированию. Таким путём достигают вы сокой степени очи ­ стки вируса.

Центрифугирование в градиенте плотности. П ри­ меняют для очистки вирусов и определения их плотное-

ти. При этом методе в центрифужную пробирку слоями наливают растворы вещества (например, сахарозы), име­ ющие разную плотность, причём самую вы сокую плот­ ность (выш е, чем ожидаемая плотность вируса) создают на дне пробирки, к поверхности плотность постепенно убывает. Очищаемую вируссодерж ащ ую взвесь наслаива­ ют сверху. Во время центрифугирования частицы различ­ ных плотностей распределяются в разных слоях раствора в виде отдельных зон. Вирусы, имеющ ие определённую плотность, отличную от плотности тканевых частиц, рас­ пределяются в одной из зон и могут быть выделены в чи­ стом виде.

Фильтрование вируссодержащей жидкости через ко­ лонки, заполнение сефадексом (декстрановый гель). Раз­ деляющие свойства такой колонки основаны на том, что частицы разной величины проходят через неё с различ­ ной скоростью , причём крупные быстрее мелких. Соби­ рая отдельные порции фильтрата, в одной из них получа­ ют очищ енный вирус.

Адсорбция вирусов на различных адсорбентах с пос­ ледующей элюцией. Подобрав определённые условия, уда­ ётся сорбировать вирус на некоторы х веществах (ионооб­ менных смолах, бентионите, гипсе и др.), а затем извлечь их (элюция), при этом примеси остаю тся на адсорбенте, а в растворе оказывается очищенный вирус.

Применяют и другие методы очистки, например, осаж ­ дение вирусов алкоголем, высаливание и др.

Если необходима дальнейшая очистка вируса или нужно изучить составляю щ ие его компоненты , применяют раз­ личные методы фракционирования, то есть разделение изучаемого препарата вируса на несколько фракций, пос­ ле чего исследую т каждую из них отдельно. Для фракци­ онирования используют электрофорез, хроматографию, ионообменные смолы.

Ультрафильтрация. Долгое время ультрафильтрация через специальные мелкопористые фильтры различных типов (керамические или «свечи», пластинчатые — асбе­ стовые и мембранные) была основным способом очистки

вируссодержащих материалов от других микроорганизмов и других посторонних частиц. Однако, ввиду больш их потерь вирусов вследствие адсорбции вирусов на фильт­ рах и забивании их пор фильтруемыми частицами, а так­ же значительной трудоёмкости этого метода, в настоящ ее время ультрафильтрацию как способ очистки вируссодер­ жащего материала почти не применяют.

Методы ультрафильтрации используют в вирусологи­ ческой работе, главным образом, для «холодной» стери­ лизации различных растворов, питательных сред, сы во­ роток и других ж идкостей, не переносящ их воздействия повышенных температур. При этом следует помнить, что данный способ стерилизации не вполне надёжен, так как ультрафильтры пропускают объекты малых размеров (ви­ русы, зернистые элементы L-форм, микоплазм и др.).

Микроскопические методы исследования

ввирусологии

1.Электронная микроскопия

Применение электронного микроскопа чрезвы чайно расширило наши знания в области морфологии и ультра­ структуры вирусов, позволило изучить закономерности взаимодействия вируса и клетки, этапы морфогенеза ви ­ русов в процессе их репродукции. Электронноскопию и, особенно, иммуноэлектронноскопию применяют при ди ­ агностике некоторы х вирусных инфекций.

Элект ронноскопические препарат ы . Их готовят из очищенных и концентрированных вируссодерж ащ их взве­ сей или ультратонких срезов тканей, заражённых вируса­ ми. Вирусные объекты наносят на специальные плёнкиподложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-под- ложки долж ны бы ть очень тонким и (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными. Х о р о ­ шо себя зарекомендовали коллоидийно-угольные плёнки. Плёнки наносят на поддерживающ ие сеточки из меди (ди­ аметром 2 -3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами, которые приведены ниже.

Методы напыления металлами (теневой обработ­ ки). Применяют для получения контрастны х препаратов. Пары тяж ёлы х металлов (золота, платины, урана и др.), образующ иеся в специальном приборе в условиях вакуу­ ма и вы сокой температуры, направляют под острым уг­ лом на вируссодерж ащ ий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла, за исключением сто­ роны, закрытой объектом, что создаёт эффект отбрасыва­ емой тени. М етод напыления создаёт объёмность изобра­ жения, позволяет хорош о изучить форму и величину ви­ рионов, строение их поверхности. Но внутренняя структура вируса недоступна для наблюдения.

Метод негативного контрастирования. Наиболее ча­ сто применяемый метод получения контрастных препара­ тов, позволяющ их выявлять как строение поверхности ви­ рионов, так и их внутреннюю структуру. Принцип этого метода основан на том, что при обработке препарата неко­ торыми солями тяж ёлых металлов, например, 1 -2% -н ы м раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты , создаётся бо­ лее плотный слой, не пропускающ ий электроны, на кото­ ром хорош о видны более электроннопрозрачные исследу­ емые объекты .

Кроме негативного контрастирования применяют так­ же метод позитивного контрастирования, при котором соли тяжёлых металлов, например, 1 -2% -н ы м раствор ура- нил-ацетата, соединяясь с веществами, входящими в со­ став вирионов, как бы «окрашивают» их, в результате чего на светлом фоне видны более тёмные вирусные структуры.

Метод ультратонких срезов в сочетании с негатив­ ным контрастированием. Является наилучшим для нау­ чения тонкого строения вирионов и изучения этапов вза­ имодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наи­ более слож ен . Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодерж ащ его материала фикси­ руют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обез­ воживают путём последовательного помещения в спирты возрастающ ей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются

твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщ иной 1 0 -2 0 нм на специальном м икрото­ ме. Полученные срезы контрастирую т, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты или уранил-ацетата.

Приготовленные выш еописанными способами препара­ ты изучают в просвечивающ ем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0 ,2 -0 ,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюоресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют спе­ циальные фотопластинки, с которы х получают отпечат­ ки. Получаемые увеличения: х1 0 0 0 0 0 -х 4 0 0 0 0 0 .

Сканирующ ая элект ронная м икроскопия. О сущ еств­ ляется с помощ ью сканирую щ его (растрового) электрон ­ ного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещ ается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излу­ чение вторичных электронов, которое, проходя через ка­ тодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изобра­ жение объекта на флюоресцирующ ем экране (процесс сх о ­ ден с формированием телевизионного изображ ения).

Сканирующая микроскопия позволяет получать трёх­ мерные изображения вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их по­ верхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующ его микроскопа рав­ на 7-20 нм.

2. Световая м икроскопия В световом микроскопе мож но увидеть крупные виру­

сы, размеры которы х находятся в пределах разрешающей способности микроскопа — не менее 0,2 мкм, а также внут­ риклеточные включения в поражённых вирусом тканях.

Крупные вирусы, например, поксвирусы , и включенш обнаруживают с помощ ью специальных методов окраски в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют ] люминесцентную м икроскопию . Как правило, эти иссле дования дают лишь предварительные результаты, не ис бавляя от использования других методов лабораторно: диагностики вирусны х инфекций.

Культуры клеток имеют первостепенное значение в вирусологии. Они ш ироко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незамени­ мы при проведении научных исследований в области ви ­ русологии.

Культуры клеток являются наиболее универсальным способом выделения и культивирования вирусов, так как к подавляющему больш инству вирусов удаётся подобрать высокочувствительные культуры , на которы х данный ви ­ рус способен размножаться.

Большим удобством в работе является наличие види­ мого цитопатического действия вирусов на клетки, бла­ годаря котором у легко обнаруживать присутствие вируса непосредственно в заражённой клеточной культуре.

Культуры клеток создают наиболее стандартные усло­ вия для культивирования вирусов по сравнению с други­ ми методами, так как состоят из однородных клеток, на­ ходящихся в сходны х условиях, и не содерж ат антител и неспецифических ингибиторов.

Из недостатков следует отметить трудоёмкость приго­ товления клеточных культур, а также нередкую заражён­ ность тканей, из которы х готовят первичные культуры клеток, латентными вирусами, а такж е контаминацию этих клеток микоплазмами, бактериями, грибами.

Условия получения клеточных культур

Для успеш ного получения клеточных культур и после­ дующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансирован­ ной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Для этой цели использую т солевые растворы и вирусо­ логические питательные среды. При их изготовлении и применении следует соблюдать целый ряд условий, опи­ санных ниже.

Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глута-

58 Общ ая медицинская вирусология

мат, лейцин, изолейцин, валин, фенилалнин, аргинин, лизин, гистидин, триптофан, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови.

И зот оничност ъ и буф ерност ь ср еды поддерживается с помощ ью неорганических солей. Оптимальным являет­ ся pH 7 ,2 -7 ,4 , при длительном культивировании клеток значение pH долж но оставаться в пределах 6 ,8 -7 ,8 . П о­ стоянство pH в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Ста­ билизации значения pH способствует выращивание куль­ тур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми проб­ ками, вследствие чего не улетучивается С 02 (в противном случае это привело бы к сдвигу pH в щ елочную сторону).

Контроль за реакцией ср еды осущ ествляется путём до­ бавления индикатора фенолрот: при pH 6 ,8 -7 ,2 среда имеет жёлтый цвет (с переходом в оранжевый), при pH 7 ,2 -7,4 — оранжево-розовый, при pH 7 ,4 -7 ,6 — красный, при pH 7 ,7 -7 ,8 — красно-фиолетовый. Для более точного опреде­ ления pH применяют потенциометр.

Во время приготовления клеточных культур к соле­ вым растворам и питательным средам нередко добавляют ант ибиот ики, чтобы избежать бактериального и грибко­ вого загрязнения. Применяют пенициллин и стрептоми­ цин (по 60 ООО ЕД /мл), тетрациклины, доксициклин, дру­ гие антибиотики ш ирокого спектра действия в концент­ рации 0 ,1 -0 ,0 1 м г/л ; противогрибковые антибиотики — нистатин (20 Е Д /мл) и фунгизон. Применение антибиоти­ ков необходимо, если культуру клеток готовят из ткани, контаминированной микроорганизмами. Применение ан­ тибиотиков не освобождает от соблюдения асептики на всех этапах работы с культурами клеток и постановки контролен на бактериологическую стерильность. При и с­ пользовании стерильных тканей и наличии оптимальных условий для работы предпочтительнее не пользоваться антибиотиками, так как они могут оказать неблагоприят­ ное воздействие на культивируемые клетки.

Для приготовления питательной среды требуется вода высокой ст епени очист ки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяж ёлы х металлов. Рекомендует­ ся применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищ енную в ионообменных колонках.

Работу с культурами клеток проводят в тщательно об­ работанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла (например, типа «П ирекс»). Очень удобна пластиковая посуда из полистирола для одноразового и с­ пользования.

Приготовленную культуру клеток инкубирую т в тер­ мостате при температуре 3 6 ,0 -3 8 ,5 С.

Солевые р аст воры

Солевые растворы имеют состав солей, качественно и количественно приближ аю щ ийся к составу ж идкостей животного организма. Основные назначения этих солей — создание буферности и изотоничности среды и обеспече­ ние наиболее важными неорганическими ионами. П ри­ сутствие ионов кальция и магния необходимо для дея­ тельности ряда клеточных ферментов, а также способствует прилипанию клеток к стеклу в процессе культивирова­ ния. Фосфаты и ионы бикарбоната, наряду с ролью бу­ ферных систем, принимают участие в основных биохим и ­ ческих процессах, происходящ их в тканевых культурах. Как правило, в состав солевого раствора входит глю ко­ за — основной источник энергии, необходимый для обме­ на веществ клетки. Кроме того, глюкоза служит метабо­ литом в процессе синтеза ряда аминокислот, а также н ук ­ леиновых и ж ирных кислот.

Солевые растворы обеспечивают переживание клеток вне организма; они служат для промывания тканей и кле­ ток в процессе приготовления клеточных культур; они являются основой для приготовления вирусологических питательных сред.

Наиболее употребительными солевыми растворами яв­ ляются растворы Хенкса и Эрла (табл. 4).