Вирусология общая Горячкиной

рекомбинантная ДНК. И мею тся наборы молекулярных зондов для определения многих вирусов. Такие наборы клонированных фрагментов вирусны х геномов составля­ ют библиотеку или банк генов, они имеются в ряде стран, в том числе и в России.

При постановке реакции молекулярной гибридизации зонды метят радиоактивной (Р32), флюоресцентной или биотиновой меткой, соединяют с исследуемым материа­ лом, содерж ащ им определяемую нуклеиновую кислоту, подвергш ую ся денатурации. Если зонд (фрагмен вирусно­ го генома) комплементарен цепи определяемой нуклеино­ вой кислоты , происходит гибридизация в комплементар­ ном участке.

После отжига зонд оказывается включенным в ренатурированную нуклеиновую кислоту и может быть обнару­ жен по имеющ ейся метке. Выявление наступившей моле­ кулярной гибридизации позволяет установить природу оп ­ ределяемого вируса. Этот метод применяют в первую очередь для определения в клиническом материале персистирую- щ их вирусов, при латентной вирусной инфекции, для вы ­ явления вирусов, которые не удается культивировать в культуре клеток. Молекулярная гибридизация — вы соко­ специфичный метод, ее чувствительность находится на уровне иммунохимических методов, например, иммуно-фер- ментного анализа, а именно около 10~14 г/м л .

Еще более чувствительным (до 10-18 г), специфичным и довольно дешевым методом оказалась полимеразная цеп­ ная реакция.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)

Эта реакция была предложена К .М юллисом в 1983 г., получившим за свое открытие Нобелевскую премию (1993). Это откры тие стало настоящ им прорывом в молекуляр­ ной биологии и медицине. Следует отметить, что способ получения и свойства главного компонента реакции —

ф ерм ент а т ерм ост абильной Д Н К -полим еразы , вы де­

120 Общ ая медицинская вирусология

ленной из бактерии Thermus aquaticus был опубликован А. Калединым с соавторами в 1980 г.

Полимеразная цепная реакция, такж е как и молеку­ лярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарности це­ пей ДНК. Новым важным принципом реакции является использование термостабильной ДНК -полимеразы, при участии которой происходит амплификация — ум нож е­ ние определяемых генов (вирусны х, бактериальных) или их фрагментов с определенной нуклеотидной последова­ тельностью ДНК. В результате реакции исследуемый ге­ нетический материал накапливается в значительном к о ­ личестве и мож ет быть легко выявлен и идентифициро­ ван. Именно на амплификации генов или их фрагментов основана «сверхчувствительность» этой реакции.

В реакции участвую т следующ ие ингредиенты:

-определяемая ДНК вирусов или других инфекци­ онных агентов в испытуемом биологическим мате­ риале, который предварительно концентрируется;

-праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) — корот­ кие цепочки ДНК с нуклеотидной последовательно­ стью комплементарной 3 ’ -концам каждой из двух цепей определяемой ДНК. Праймеры получают из нуклеиновых кислот различных вирусов и бактерий, их нуклеотидную последовательность определяют ме­ тодом секвенирования;

-свободные нуклеотиды (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 4-х типов с различными азотистыми осн о ­ ваниями) — необходимый материал для осущ еств­ ления амплификации;

-фермент термостабильная ДНК-полимераза —

производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Кроме термоста­ бильной ДНК-полимеразы, выделяемой из Thermus aquaticus, этот фермент получают генно-инженер­ ным методом.

Сущ ность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящ аяся в тестируемом биологическом материале,

подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отж ига присоединяются, вследствие их комплементарности, к З’ -концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат «затравками» для пос­ ледующ ей достройки цепей ДНК, осущ ествляемой термо­ стабильной ДНК -полимеразой, которая использует для этой цели свободные нуклеотиды.

В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается (из одной матрицы ДНК образуется две копии), то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 2 5 -4 0 повторны х циклов ампли­ фикации и в итоге за 2 -3 часа получаю т миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов, бактерий и др. (по формуле: 2п, где п равно количеству циклов).

П олимеразную цепную реакцию проводят в 0 ,5 -1 ,5 мл микроцентриф уж ных пробирках в амплификаторах, к о ­ торы е автоматически регулирую т смену температуры . Каждому из 3-х этапов цикла амплификации — денатура­ ции ДНК, отж ига и достройки — необходима инкубация образцов при различном температурном режиме (см. сх е ­ му П Ц Р, стр. 122).

1. Д ен ат урац ия — разъединение определяемой двух­ спиральной ДНК на две изолированные цепи при нагре­ вании до 9 0 -9 5 ”С в течение 0 ,5 -1 ,0 мин.

2. Отжиг — восстановление двухцепочечной структу­ ры определяемой ДНК в области присоединения компле­ ментарного праймера — проводится при температуре 4 0 -

60С 0,5 мин.

3.У длинение (эл он га ц и я) — достройка каждой цепи определяемой ДНК до исходного двухцепочечного состоя ­ ния с помощ ью термостабильной ДНК-полимеразы — про­ водится при температуре 7 0 -7 5 'С в течение 2 -5 мин.

Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощ ью электрофореза в полиакриламид­ ном геле, авторадиографией (при участии в реакции сво­ бодных нуклеотидов, меченных изотопами) или другими методами. ПЦР — вы сокоспецифичная реакция: если ис-

следуемый образец не был комплементарен праймерам, то результат реакции отрицателен.

С помощ ью ПЦР возмож но определение не только н ук ­ леотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РН К -вирусов (для этого в ре­ акцию вводят обратную транскриптазу).

Таким образом, ПЦР является высокочувствительным и специфичным молекулярно-генетическим методом иссле­ дования, позволяющем выявлять присутствие различных вирусов и многих других патогенных агентов. Метод осо ­ бенно ценен для диагностики латентных вирусных инфек­ ций и ВИЧ-инфекции. ПЦР применяют также при диагно­ стике холеры (обнаруживают ген, детерминирующий син ­ тез энтеротоксина у холерного вибриона), бруцеллеза, легионеллеза, микобактериозов и других инфекций.

Впоследние годы ПЦР приобретает все большее значе­ ние как ценный экспресс-метод лабораторной диагности­ ки инфекционных заболеваний. Неуклонно расширяется круг инфекций (как вирусной, так и другой этиологии), при которы х применяют ПЦР. Соверш енствуются м ето­ дики постановки ПЦР, предлагаются ее различные м оди ­ фикации.

Вчастности, разработана количественная ПЦР, п озво­ ляющ ая определять концентрацию специфических н ук ­ леотидных последовательностей в исследуемом материа­ ле, следить за ее повышением или понижением. Такой контроль облегчает прогноз заболевания, позволяет оце­ нивать эффективность применяемой терапии.

ПРИЛОЖЕНИЕ.

Планы практических занятий

по общей вирусологии

Занятие № 1

Тема:

Основные свойства вирусов. Химический состав и строение вирионов. Классификация вирусов.

Методы выделения и культивирования вирусов

План занятия

1.Знакомство с правилами работы в вирусологичес­ кой лаборатории.

2.М орфология и ультраструктура вирусов: демонст­ рация электронных микрофотографий вирусов ж и ­ вотных и человека.

3.М етоды выделения и культивирования вирусов:

а) в культуре клеток:

-демонстрация солевых растворов и питательных сред;

-изучение различных типов однослойных куль­ тур клеток;

б) в развивающемся курином эмбрионе:

-изучение строения куриного эмбриона;

-способы заражения;

в) в организме восприимчивых лабораторных ж и ­

вотных (студенты изучают самостоятельно).

4.Заполнить таблицу 11 «Оценка методов культиви­ рования вирусов».

Занятие № 2

Т ем а:

Взаимодействие вируса с клеткой. Особенности репродукции вирусов. М етоды индикации и идентификации вирусов в культуре клеток

План занятия

1.Этапы репродукции ДНК- и РНК-геномных вирусов.

2.Методы индикации (обнаруж ения) вирусов:

а) по цитопатическому действию (ЦПД) вируса на

3.Методы идентификации вирусов в культуре кле­ ток — реакции нейтрализации с диагностически­ ми вируснейтрализующ ими сыворотками. Выявле­ ние нейтрализации по:

а) отсутствию ЦПД; б) отсутствию или уменьш ению бляш кообразова-

ния; в) реакции задержки гемадсорбции;

г) реакции нейтрализации по цветной пробе.

4.Определение титра вируснейтрализующей сы ворот­ ки по цветной пробе (демонстрация).

5.Вскрытие куриных эмбрионов, зараженных виру­ сами.

6.Заполнение таблицы № 12 «М етоды индикации и идентификации вирусов».

Занятие № 3

Т ем а:

Вирусные инфекции, их особенности. П ротивовирусны й иммунитет.

Молекулярно-генетические м етоды исследования.

Методы индикации и идентификации вирусов (продолж ение) — РГА, РТГА, реакция нейтрализации in vivo на уровне клетки

План занятия

1.П ротивовирусный иммунитет; неспецифические и специфические факторы защ иты, механизмы их противовирусного действия.

2.Реакция гемагглютинации вирусов (РГА), ее сущ ­ ность и значение для индикации вируса и опреде­ ление его титра (демонстрация).

3.Идентификация вируса в реакции торможения ге­ магглютинации (РТГА) — демонстрация.

4.Реакция нейтрализации вирусов на мыш ах и раз­

вивающ ихся куриных эмбрионах (студенты изуча­

ю т самостоятельно).

5.М олекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусны х инфекций; молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция

(П Ц Р), сущ ность, принципы постановки.

6.Разобрать и перенести в альбом схемы молекуляр­ ной гибридизации и ПЦР.